Name: optimizing the setup and conditions for ex vivo electroretinogram to study retina function in small and large eyes
Uploaded: 2022-06-27T13:00:00
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この研究は、National Eye Instituteの助成金EY02665およびEY031706、およびInternational Retinal Research FoundationからVinberg博士へのNational Institutes of Health Core Grant(EY014800)、およびニューヨーク州ニューヨークのユタ大学眼科・視覚科学部へのResearch to Prevention Blindnessからの無制限助成金の支援を受けた。フランス・ヴィンバーグ博士は、失明予防研究/H.ジェームズ博士とキャロルフリーキャリア開発賞、およびARVO EyeFind助成金のシルケベッカー博士の受賞者でもあります。図2Eに示す記録に使用されるドナーアイを提供してくれたスクリップス研究所のアン・ハンネケン博士に感謝します。

マウスを用いたすべての実験は、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドに従って実施され、ユタ大学の施設内動物研究委員会によって承認されました。このビデオのデモンストレーション用の豚の目は、食肉処理場(持続可能な豚資源、ジョンソンビル)から死後に入手しました。眼は、脳死または心臓死後にヒトドナーから、FDA、臓器調達組織協会(AOPO)、およびアイバンクオブアメリカ協?...

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	<li>Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).</li><li>Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog.">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).</li><li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve.">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).</li><li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+(Rana+temporaria).">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).</li><li>Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+phototransduction+and+light+signal+transmission+during+type+2+diabetes.">Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes.</a> BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).</li><li>Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inhibiting+glutamine+synthetase+and+blocking+glutamate+uptake+on+b-wave+generation+in+the+isolated+rat+retina.">Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina.</a> Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).</li></ol>

もともとは両生類の網膜10からの網膜光応答を測定するためにホルムグレンによって1865年に開発されましたが、当初は技術的な制約によりERGは広く使用されていませんでした。それにもかかわらず、Ragnar Granitらによる独創的な研究は、ERGの細胞起源を特定し、ex vivoで光受容体およびONバイポーラ細胞応答を測定した11,12,13<s...

網膜電図は、光に応答して網膜機能を測定する1.これは、網膜生理学と病態生理学を研究し、網膜疾患の治療の成功を測定するために不可欠です。in vivo ERGは、無傷の生物の網膜機能を評価するために広く使用されていますが、重大な制限があります2,3。これらの中で、in vivo ERGにおける個々の網膜細胞タイプの定量分析は、すべての網膜細胞から光刺激への潜在的な変化の合計を記録し、したがって応答を重ね合わせるため、妨げられています4。さらに、網膜への薬物の添加を容易に許さず、全身の影響に対して脆弱であり、信号対雑音比が比較的低い。これらの欠点は、単離された網膜2、3、5、6の機能を調べるex vivo ERGにおいて排除される。ex vivo ERGは、薬理学的阻害剤の添加およびスーパーフューセートに添加することができる治療薬の容易な評価により、特定の網膜細胞型からの大規模で安定した応答の記録を可能にする。同時に、全身的影響の影響を除去し、生理学的ノイズ(例えば、心拍または呼吸)を排除する。
ex vivo ERGでは、網膜または網膜試料が単離され、標本ホルダー3,5のドーム上に感光体側を上にしてマウントされる。試料ホルダーは組み立てられ、網膜に加熱された酸素化媒体を供給する灌流システムに接続され、コンピューター制御の光刺激を提供するように変更された顕微鏡のステージに配置されます。光によって誘発された応答を記録するために、試料ホルダーはアンプ、デジタイザ、および記録システムに接続されています(図1)。この技術は、光刺激のパラメータを変更し、薬理学的物質を添加することにより、桿体および錐体光受容体、ONバイポーラ細胞、およびミュラーグリアからの応答の単離を可能にする。
既存のパッチクランプまたは多電極アレイ(MEA)セットアップは、市販のex vivo ERGアダプターまたはカスタムポリカーボネートコンピューター数値制御(CNC)機械加工された標本ホルダーと組み合わせて、ex vivo ERGを記録するように変換して、マウスなどの小動物モデルからの網膜の光応答を測定することができます。この変更により、特殊な機器の必要性を最小限に抑えながら、ex vivo ERGのアクセシビリティが向上します。試料ホルダーの設計により、取り付け技術が簡素化され、電極が統合されるため、以前に報告された経網膜ex vivo ERG法と比較して、微小電極の操作が不要になります7。試料ホルダー内の灌流速度と温度は、光受容体とONバイポーラ細胞からの応答特性に影響を与える重要な要素です。これらの条件を調整することにより、ex vivo ERGを単離されたマウス網膜から長期間にわたって確実に記録することができる。最適化された実験条件により、大型動物の目やヒトドナーの目など、より大きな網膜からの網膜パンチでのex vivoERG記録が可能になります8。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mm socket</td>
			<td>WPI</td>
			<td>2026-10</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl Electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EP1</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#39; medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td>perfusion media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>barium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0750</td>
			<td>potassium channel blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP4</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>0101</td>
			<td>broad spectrum glutamatergic antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OcuScience Ex Vivo ERG Adapter</td>
			<td>OcuScience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>ex vivo ERG specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded luer connector</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K222 or 51525K223</td>
			<td>materials to prepare electrode</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the setup and conditions for ex vivo electroretinogram to study retina function in small and large eyes

網膜ニューロン光応答の測定は、健康な網膜の生理機能を調査し、網膜疾患の病理学的変化を決定し、治療的介入をテストするために重要です。 ex vivo 網膜電図(ERG)は、特定の薬理学的物質を添加し、全身の影響とは無関係に組織固有の変化を評価することにより、単離された網膜の個々の細胞タイプからの寄与を定量化することができます。網膜の光応答は、既存のパッチクランプまたは微小電極アレイ装置から変更された特殊な ex vivo ERG試料ホルダーと記録セットアップを使用して測定できます。特に、ONバイポーラ細胞だけでなく光受容体の研究も、時間の経過に伴う ex vivoERG における光応答のゆっくりとした、しかし進行性の低下によって妨げられてきました。灌流速度の向上と灌流液温度の調整により、 ex vivo 網膜機能が改善され、応答振幅と安定性が最大化されます。 ex vivo ERGは、個々の網膜神経細胞タイプの研究を独自に可能にします。さらに、応答振幅と安定性を最大化するための改善により、大型動物やヒトドナーの目からの網膜サンプルの光応答の調査が可能になり、 ex vivo ERGは網膜機能の調査に使用される技術のレパートリーに貴重な追加となります。

エクスビボERGは、例えばマウス網膜からの再現性のある安定した光受容体およびONバイポーラ細胞の光応答の記録を可能にします(図2A-C)。ヒトドナー網膜からの光受容体応答の記録は、死後最大5時間の除核遅延(図2D)およびONバイポーラ細胞応答の記録が<20分の除核遅延(図2E)で可能です。大き?...

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Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

既存の多電極アレイまたはパッチクランプ装置の改造により、 ex vivo 網膜電図がより広く利用できるようになります。 生体外 光応答を記録および維持するための改善された方法は、健康な網膜、眼疾患の動物モデル、およびヒトドナー網膜における光受容体およびONバイポーラ細胞機能の研究を容易にします。

大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

このプロトコルは、ex vivo ERG、特にONバイポーラ細胞によって産生される非常に感度の高いB波で網膜機能を維持するために必要な条件を示しています。ex vivo ERGを使用すると、薬理学的物質の導入を容易にしながら、高い信号対雑音比でさまざまな種類の網膜ニューロンの機能を測定することができます。この方法は、網膜機能および疾患に対する薬理学的物質の有効性を定量化するのに特に適している。まず、ex vivo ERG試料ホルダーをヘッドステージを介して差動アンプに接続して、多電極アレイのセットアップを変換します。アンプは、多電極アレイシステムのインターフェースボードのアナログ入力に接続する必要があります。多電極アレイ用の記録ソフトウェアを使用して、ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。差動アンプのゲインを100に設定し、デジタイザの仕様に応じて10倍の電圧増幅を追加します。ローパスフィルターを100ヘルツに設定します。あるいは、パッチクランプのセットアップを変換するには、ex vivo ERG検体ホルダーをヘッドステージを介して差動アンプに接続し、差動アンプはパッチクランプアンプのヘッドステージに接続する必要があります。パッチクランプシステムソフトウェアとデジタイザを使用して、ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。前に示したようにパラメータを設定します。適切な波長のLEDを顕微鏡に接続します。光刺激を制御するには、デジタイザからのアナログ出力によって制御されるLEDドライバを使用します。光刺激のトリガーを可能にする記録ソフトウェアでLEDを制御します。次に、フォトダイオードを使用して、標本ホルダー内の網膜の位置でのLEDの光出力を校正します。必要に応じて、減光フィルターを挿入して、光路の光の強度を暗くします。電極を準備するには、塩化銀ペレット電極をネジ付きルアーコネクタに挿入します。ルアーコネクターの内側をホットグルーで満たし、非ネジ側からホットグルーに2ミリのソケットを差し込みます。EP-1電極の銀線を2ミリソケットにはんだ付けします。糸にOリングが付いた完成した電極をex vivoERG試料ホルダーの電極ポートにねじ込みます。人間のドナーの目を含む大きな目の場合は、残りの結合組織の地球をきれいにし、前部と水晶体を取り外します。メスを使用して、リムバスから約3ミリメートルの切り込みを入れます。湾曲した解剖ハサミを切開部に挿入し、辺縁に沿って切断してレンズで目の前部を取り除きます。3〜6ミリメートルの使い捨て生検パンチでex vivo網膜電図用の網膜標本を入手します。組織を検体ホルダーに取り付けるには、検体ホルダーの下半分を大きなペトリ皿に入れ、検体ホルダーのドームがちょうど水没するように酸素化エイムズ培地で満たします。細かい鉗子で網膜の端を注意深くつかみ、網膜をex vivo標本ホルダーのドームに移し、感光体側を上に向けています。標本ホルダーをエイムズの溶液から持ち上げ、網膜が所定の位置に留まるように注意します。試料ホルダーのプレートを完全に乾燥させて、ノイズ、電気的クロストーク、信号シャントを最小限に抑えます。次に、試料ホルダーの両半分を4本のネジで組み立て、灌流ラインを接続します。試料ホルダーの下半分の電極を打ち込み、アノードケーブルを網膜内側に、カソードケーブルを感光体側に接続します。検体ホルダーに少なくとも1ミリリットルの酸素化エイムズ培地を10〜20分間灌流して、光応答を安定させます。Ex vivo ERGは、マウス網膜からの光受容体およびONバイポーラ細胞光応答の記録を可能にしました。ヒトドナー網膜からの光受容体応答の記録は、核摘出の死後最大5時間の遅延と、ONバイポーラ細胞応答の20分未満の遅延で可能でした。理想的な条件下では、両方の細胞タイプの応答振幅と動態は時間の経過とともに比較的安定していましたが、網膜が標本ホルダーに取り付けられてから40〜45分後にゆっくりと減少しました。試料ホルダー内の温度の低下は、光受容体とONバイポーラ細胞の両方の動態を大幅に遅くしました。ただし、B波の振幅は減少しましたが、A波の振幅は減少しませんでした。逆に、灌流速度を遅くすると、光受容体とONバイポーラ細胞の両方の応答の振幅が減少しましたが、A波またはB波の暗黙の時間には影響しませんでした。灌流を10分間停止した後、再灌流すると、光受容体応答が保存されたONバイポーラ細胞機能が完全に失われました。十分な灌流速度と生理学的温度は、特にex vivo ERGのONバイポーラ細胞から安定した応答を得るために重要です。このプロトコルにより、ヒト黄斑と末梢における視受容体機能の違いを詳細に調査することができ、以前はヒト以外の霊長類でしか実行できなかった質問に答えることができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

マウス後脳<em&gt;生体外</em&gt;文化顔面Branchiomotorニューロンの移行を研究する

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

齧歯類網膜とリモート四肢虚血プレコンディショニングの保護効果に機能を評価するために電図を用いて、

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Rabies Necropsy Techniques in Large and Small Animals

大小動物における狂犬病壊死技術

The New York State Department of Health (NYSDOH) Rabies Laboratory receives between 6,000 to 9,000 specimens annually and performs rabies testing for the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

イン・ヴィヴォ 大型動物の眼球神経節細胞と視神経機能と構造を評価する方法

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...