Name: a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos at JoVE.com

وقد تم دعم هذا المشروع من قبل جمعية ماكس بلانك وحصل على تمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 (اتفاقية المنحة رقم 637840 (QUANTPATTERN) واتفاقية المنح رقم 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol>
	<li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species.">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li><li>M&#252;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system.">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li><li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion.">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li><li>Pomreinke, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BMP+signaling+and+distribution+during+zebrafish+dorsal-ventral+patterning.">Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning.</a> eLife. 6, 25861 (2017).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signaling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Soh, G. H., Pomreinke, A. P., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Nodal+and+BMP+signaling+by+mutual+signaling+effector+antagonism.">Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism.</a> Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).</li><li>Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+reorganization+of+xanthophores+fine-tunes+and+colors+the+striped+pattern+of+zebrafish.">Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish.</a> Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).</li><li>Frohnh&#246;fer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridophores+and+their+interactions+with+other+chromatophores+are+required+for+stripe+formation+in+zebrafish.">Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish.</a> Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).</li><li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen.">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li><li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germline+replacement.">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).</li><li>Capek, D., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration.">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), 177709 (2019).</li><li>Rogers, K. W., Bl&#228;&#223;le, A., Schier, A. F., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+stability+in+living+zebrafish+embryos+using+fluorescence+decay+after+photoconversion+(FDAP).">Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).</li><li>Carvalho, L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yolk+syncytial+layer+in+early+zebrafish+development.">The yolk syncytial layer in early zebrafish development.</a> Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).</li><li>Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+of+medaka+embryos+and+cell+transplantation+for+the+generation+of+chimeras.">Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).</li><li>Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+and+multipotency+in+retinal+stem+cells.">Fate restriction and multipotency in retinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).</li></ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

يعتمد نجاح تجربة الزرع بقوة على المهارات الحركية الدقيقة للمجرب. ومن أجل تنفيذ الإجراءات بنجاح، يلزم ممارسة هذه العملية. ومع ذلك ، فإن الأداة المعروضة هنا سهلة التعلم والاستخدام نسبيا مقارنة بالآخرين في السوق ، وبشكل عام ، لا تحتاج إلا إلى بضعة أيام من الممارسة.
يمكن تعزيز نجاح عملية الزرع من خلال اتخاذ العديد من الاحتياطات. خطوة واحدة هي التأكد من أن micromanipulator هو من نوعية جيدة وقادرة على التشغيل السلس. إضافة العين مع التكبير أعلى إلى المنظار المجسم يمكن أن تساعد على وضع الإبرة بدقة بالنسبة للجنين. كما أن استخدام سمك الحمار الوحشي أو ميداكا الذي يتكاثر بشكل جيد للحصول على أجنة سليمة والحرص على عدم إتلاف الأجنة أثناء المناولة (خاصة أثناء وبعد خطوة التخلص من المشيمة) سيعزز أيضا معدل النجاح.
يمكن أن تكون المشاكل المتعلقة بالسمية المتأخرة أكثر صعوبة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. إذا توفي الجنين بعد بضع ساعات - ولكن ليس بعد زرعه مباشرة - فقد يكون الصفار قد تضرر من الإبرة (على سبيل المثال، عن طريق دخول الجنين بعمق شديد)، أو ربما تم إخراج الخلايا بقوة كبيرة. ويمكن أن ينتج تأخر السمية والوفاة الجنينية أيضا عن صفار أو حطام خلايا حقن مع الخلايا المانحة؛ يمكن أن يكون سبب آخر تدهور HEPES المخزن المؤقت في الحل Ringer. يمكن التغلب على هذه المشاكل عن طريق غسل الخلايا (انظر الخطوة 1.3.8) أو ببساطة باستخدام دفعة جديدة من المخزن المؤقت، على التوالي. وعلاوة على ذلك، قد تنتج الأجنة المضيفة المشوهة في تجارب زرع الجرثومة عن تركيزات مورفولينو عالية للغاية. من الأهمية بمكان استخدام ما يكفي من مورفولينو لإبطال الجرثومة البرية للمضيف بشكل كامل ، وبالتالي منع هذه الخلايا من المساهمة في النسل - ولكن في الوقت نفسه ، يجب تجنب تركيزات مورفولينو العالية بشكل مفرط. ولذلك فإن كميات المورفولينو المتسقة عبر جميع الأجنة المضيفة المحقونة (بضع مئات في تجربة نموذجية) هي المفتاح لنجاح عمليات زرع الجراثيم. ويمكن مساعدة هذا عن طريق استكمال مزيج حقن مورفولينو مع dye14 التتبع مرئية بسهولة, والتي يمكن تعقبها تحت مجسم مفلورة لضمان أن جميع الأجنة تلقي نفس حجم الحقن.
تتضمن الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول حصريا التلاعب بالخلايا في أجنة حمار وحشي أو ميداكا في مرحلة blastula ، ولكن في المستقبل ، من المرجح أن يكون من الممكن تكييف الجهاز مع مراحل وأنواع مختلفة عن طريق تغيير قطر وشكل إبرة الزرع.

من التجارب الكلاسيكية مانغولد وسبيمان التي أظهرت وجود منظم تعليمات تشكيل محور الجنين1، زرع الخلايا بين الأجنة أصبح تقنية راسخة لدراسة التطور الجنيني2،3،4،5،6،7،8،9،10 . ويتكون الإعداد الشائع الاستخدام للزرع من حقنة ضيقة بالغاز يتم التحكم فيها بواسطة ميكرومتر متصلة بحامل ميكروبايت من خلال أنابيب مرنة وخزان مليء بالزيت المعدني12,13. في هذا الإعداد، يتم نقل المكبس من الحقنة من خلال المسمار. يتم نقل الضغط المتولد بهذه الطريقة إلى الميكروباينيت ويستخدم لسحب الخلايا من جنين واحد وإيداعها في جنين آخر. ومع ذلك، يتكون هذا الجهاز الذي يعمل هيدروليكيا من أجزاء كثيرة وشاقة لتجميع من الصفر. ويمكن أيضا شراء أجهزة مماثلة كجهاز عمل كامل ، وعادة ما تباع كمقنات دقيقة يدوية ، وتكلف هذه الإصدارات التجارية عادة أكثر من 1500 دولار أمريكي. في كل من النسخة المنزلية والتجارية ، يتم فصل micropipette للتلاعب الجنين من الجهاز توليد الضغط (حقنة الغاز ضيق) من خلال أنابيب مملوءة بالنفط. التلاعب في micropipette وحركة المكبس ، لذلك ، يجب أن تعمل بشكل منفصل مع أيدي مختلفة ، والحد من الإنتاجية والفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن الأجهزة مرهقة للتحضير لزرع منذ أنابيب يحتاج إلى أن تكون مليئة بعناية مع النفط مع تجنب تشكيل فقاعات. هنا، نقوم بوصف جهاز بديل يعمل بالهواء المضغوط لإزالة الخلايا وزرعها غير مكلف وسهل التجميع وبسيط الاستخدام.
الجهاز المعروض هنا يتكون من 25 ميكرولتر الغاز ضيق حقنة مزودة حامل micropipette وتكاليف أقل من 80 دولارا أمريكيا تماما. يتم تجميع الجهاز بسهولة عن طريق إدخال حامل micropipette في الحقنة عن طريق تركيب قفل Luer (الشكل 1A). ثم يتم تركيب الجهاز مباشرة على ميكرومانيبولاتور، مما يسمح للمستخدم بالتحكم في كل من موقعه والشفط بيد واحدة مباشرة في المايكرومانيبولاتور. هذا يترك اليد الأخرى حرة لتحقيق الاستقرار ونقل طبق زرع تحتوي على الأجنة المانحة والمضيف. يعمل الجهاز عن طريق الشفط المباشر بالهواء ولا يحتاج إلى ملء بالزيوت المعدنية. نظرا للقوى الجذابة بين الماء وجدران الإبرة الزجاجية ، تترجم حركة كبيرة في المكبس للمحقنة إلى حركة أصغر في مستوى الماء داخل الإبرة ، طالما أن مستوى الماء في النهاية المدببة لل إبرة الزجاج. وهذا يسمح بالتحكم الدقيق في عدد الخلايا المهتتة وموقع إدراجها.
لإثبات فائدة هذا الجهاز، نقدم ثلاثة تطبيقات في أجنة حمار وحشي (دانيو ريو). أولا، نعرض كيفية توليد مصادر مترجمة لجزيئات الإشارات المفرزة، والتي يمكن استخدامها لدراسة تشكيل التدرج2،4،6. هنا، يتم حقن الأجنة المانحة مع مرنا ترميز جزيء إشارة المسمى الفلورسنت. ثم يتم زرع الخلايا المانحة المسماة بالفلورسينس إلى أجنة مضيفة من النوع البري حيث يمكن تصوير تكوين تدرج الإشارة وتحليله. ثانيا، نحن نصف كيف يمكن استخدام الجهاز لإزالة الخلايا عن طريق الخلع من أجل توليد الأجنة ذات الحجم المنخفض5،13. وأخيرا، نظهر كيفية إنتاج المسوخ الأم الزيجوتية بقوة عن طريق زرع خلايا تحمل مراسل الخلايا الجرثومية البدائية في الأجنة المضيفة التي تم فيها استئصال الخط الجرثومي 6,10. في المستقبل، يمكن تكييف جهاز الزرع الموصوف هنا بسهولة مع التلاعبات الجنينية الأخرى التي تتطلب إزالة أو زرع الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mm glass capillary, ends cut without filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mL glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To coat plastic dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnd1 morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC 
			CAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To assess YSL injections and germ-line transplantations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Kimble Chase (via Fisher)</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator at 28 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer tip 25 &#956;L Hamilton syringe, 1700 series</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Ref: 80201</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator with 3 axes of movement</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For controlling the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual pipetting pump</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>Cat. # 641</td>
			<td>For use with the glass pipettes to transfer embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For moving and rotating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF2</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and morpholino into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds, triangular grooves</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare microinjection plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection-molds, single wells</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>To prepare transplantation plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH6S10</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 
			transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340M</td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid with GFP-nos1 3&#39;UTR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3&#39;UTR of nos1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dish 100 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td>For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection and transplantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos

إن التلاعبات الجنينية الكلاسيكية، مثل إزالة الخلايا وزرع الخلايا داخل الأجنة أو بينها، هي تقنيات قوية لدراسة عمليات النمو المعقدة. تعد أجنة سمك الحمار الوحشي مناسبة بشكل مثالي لهذه التلاعبات نظرا لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة ، وكبيرة نسبيا في الحجم ، وشفافة. ومع ذلك ، فإن الأجهزة التي تم تطويرها سابقا لإزالة الخلايا وزرعها مرهقة للاستخدام أو مكلفة للشراء. في المقابل ، فإن جهاز الزرع المعروض هنا اقتصادي وسهل التجميع وبسيط الاستخدام. في هذا البروتوكول، نقدم أولا التعامل مع جهاز الزرع وكذلك تجميعه من الأجزاء المتاحة تجاريا وعلى نطاق واسع. ثم نقدم ثلاثة تطبيقات لاستخدامها: توليد الحيوانات المستنسخة خارج الرحم لدراسة تشتت الإشارات من مصادر موضعية، وتجث الخلايا لإنتاج أجنة منخفضة الحجم، وزرع الجرثومة لتوليد المسوخ الأم الزيجوتية. وأخيرا، نظهر أن الأداة يمكن أن تستخدم أيضا للتلاعب الجنيني في أنواع أخرى مثل ميداكا أسماك الأرز اليابانية.

النجاح والفشل في استخدام جهاز زرع للتطبيقات الثلاثة المذكورة أعلاه يمكن بسهولة تقييمها عن طريق الفحص البصري تحت منظار مجسم. في عمليات الزرع الناجحة ، يجب أن يبدو الجنين طبيعيا ومشابها في الشكل ووضوح الصفار للأجنة غير المخططة ، دون دموع كبيرة في blastoderm. إذا كان الجنين معطوبا بشكل واضح (الشكل 4B) ، فلن يتطور بشكل طبيعي. من الناحية المثالية، يجب أن تظهر الخلايا المزروعة التي تعبر عن علامة فلورية كأعمدة مستمرة عند النظر إليها تحت منظار مجسم مفلور (الشكل 2A، الشكل 4A). إذا كان العمود مجزأ، فهذا يشير إلى أن الخلايا تم قصها بواسطة الشفط إلى إبرة الزرع أو أن ترسب الخلايا تم بقوة كبيرة. ويمكن منع ذلك عن طريق تحريك المكبس ببطء وبلطف.
على الرغم من أن جهاز زرع قد استخدمت أساسا على أجنة حمار وحشي في مراحل blastula5,6, زرع و استئصال الخلايا العمل فقط كذلك لأجنة مرحلة blastula dechorionated من ميداكا سمك الأرز الياباني (Oryzias latipes) (الشكل 2B). وبصرف النظر عن dechorionation الجنين، الذي وصفه Porazinski، S. R. وآخرون.17، يمكن اتباع نفس الإجراءات كما هو موضح أعلاه.
في حالة زرع الجرثومة على وجه التحديد، فإن عملية زرع جيدة تؤدي إلى جنين مع عمود أفقي طويل من الخلايا مباشرة فوق هامش صفار (الشكل 4A). ومع ذلك، لا يمكن تقييم ما إذا كانت الخلايا الجرثومية قد تمت زراعتها بنجاح إلا في اليوم التالي (الشكل 4C-F) بسبب التعبير الخلفي عن GFP في مراحل blastula (الشكل 1F). ستظهر الخلايا الجرثومية البدائية كمجالات فلورية صغيرة في الأخدود مباشرة فوق امتداد الصفار (الشكل 4C-E). وجود هذه الخلايا في الموقع الصحيح يشير إلى نجاح زرع الجرثومة. الخلايا ذات الشكل المختلف ليست خلايا جرثومية (على سبيل المثال، الخلايا الممدودة هي عادة خلايا عضلية، الشكل 4F). أيضا، إذا تم العثور على الخلايا الجرثومية البدائية خارج الأخدود، وهذا يعني أنها فشلت في الهجرة بشكل صحيح، وأنها لن تكون قادرة على المساهمة في الجرثومة الجنين. وأخيرا، ينبغي أن يظهر الشكل العام للأجنة المزروعة على غرار الأجنة غير المزروعة (الشكل 4D)؛ لا ينبغي أن يكون مشوه الذيل، وينبغي أن لا يكون الرأس تقلصت أو في عداد المفقودين عيون (الشكل 4E). هذه العيوب تنتج عموما من تركيزات مورفولينو عالية بشكل مفرط أو من تلف الجنين أثناء زرع. عادة ما تؤدي تجارب زرع الجراثيم كما هو موضح هنا إلى 1-2 من أصل 6 أجنة مضيفة مع خلايا جرثومية تم زرعها بنجاح ل 60٪ -80٪ من الأجنة المانحة ، اعتمادا على تجربة المجرب. وهكذا، تحتاج الخلايا من 40-50 جنينا مانحا متجانسا إلى زرعها في 200-300 جنين مضيف لتربية ما يقرب من 30 فردا يعانون من خلايا جرثومية متحولة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> الشكل 1: تجميع واستخدام جهاز الزرع. (أ) يتم تجميع جهاز الزرع عن طريق توصيل حقنة ضيقة بالغاز مع حامل micropipette من خلال تركيب قفل Luer. ثم يتم إدخال الإبرة الزجاجية لزرعها في حامل المايكروبايت. (ب) صورة لجهاز زرع تجميعها محمولة على micromanipulator (يرجى ملاحظة أن الخلفية والتسميات قد أزيلت من الصورة). (ج) عند استخدام جهاز الزرع، من المهم التأكد من أن مستوى الماء في إبرة الزرع يبقى في النهاية مدبب. (د) يستخدم الجهاز تحت منظار مجسم لسحب وإدخال خلايا من الأجنة عن بعد ووضعها في آبار فردية من طبق زرع. (ه) بالنسبة لتوليد المصادر خارج الرحم، تؤخذ الخلايا من القطب الحيواني للجنين المتبرع (i-ii) وتنقل إلى القطب الحيواني للجنين المضيف (III-vi). (و) بالنسبة لزرع الجرثومة، يؤخذ عدد أكبر من الخلايا من هامش الجنين المتبرع (i-ii)، حيث توجد الخلايا الجرثومية. ثم يتم نقل الخلايا إلى هامش الأجنة المضيفة (III-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> الشكل 2: توليد استنساخ عن طريق زرع الخلايا. (أ) مثال على استنساخ مزدوج يولده زرع متسلسل للخلايا الفلورية (الخضراء) من متبرع حمار وحشي إلى جنين مضيف لسمك الحمار الوحشي. ويمكن استخدام المستنسخين الفرديين والمزدوجين لدراسة كيفية تشكل جزيئات الإشارات المفرزة تدرجات ندواتية2,4,5,6. (ب) مثال على استنساخ واحد تم إنشاؤه عن طريق زرع خلايا من متبرع ميداكا (Wimbledon) عبر عن eGFP معدل وراثيا (Wimbledon)17 في مضيف ميداكا من النوع البري. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> الشكل 3: توليد أجنة مخفضة الحجم عن طريق استئصال الخلايا. (أ) قبل إزالة الخلايا عن طريق الاستئصال ، يمكن تسمية YSL عن طريق حقن الأصباغ الفلورية في جانبين متعارضين من YSL. (ب) مثال على الجنين بعد حقن YSL. (ج) لتوليد الأجنة التي تقلص حجمها، تتم إزالة الخلايا من القطب الحيواني عن طريق extirpation5. (د) مثال على جنين بعد استئصال الخلايا. لاحظ أن YSL يبقى سليما. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> الشكل 4: زرع الجرثومة. (أ) مثال على نجاح زرع الخلايا المانحة (الخضراء) في المنطقة الهامشية للمضيف. (ب) مثال على عملية زرع غير ناجحة. أصيب صفار الجنين المضيف بأضرار بالغة، ولن يتمكن الجنين من النمو بشكل طبيعي. (ج) في 30 حصان، سيتم العثور على الخلايا الجرثومية المزروعة بنجاح فقط في ميسوديرم غدد الغدد التناسلية في المنطقة الأمامية من تمديد صفار. (د) مثال على عملية زرع ناجحة قامت فيها عدة خلايا جرثومية مانحة تحمل اسم GFP بملء الننض المستقبلي للمضيف. (ه) مثال على عملية زرع غير ناجحة. على الرغم من أن الخلايا الجرثومية قد وصلت إلى ميسودرم غدد الغدد التناسلية، إلا أن الجنين المضيف مشوه بشدة ولن يتطور بشكل طبيعي. (و) مثال على عملية زرع غير ناجحة. الخلايا الجرثومية الفلورية التي فشلت في الهجرة إلى الموقع الصحيح لن تعيد إسكان النواد. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. تم التقاط الصور في D-F في التكبير الكلي من حوالي 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

تعد التلاعبات الجنينية مثل استئصال الخلايا وزرعها أدوات مهمة لدراسة التطور المبكر. يصف هذا البروتوكول جهاز زرع بسيط وفعال لإجراء هذه التلاعبات في أجنة حمار وحشي.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

تمكن هذه التقنية من دراسة وظيفة ونطاق جزيئات الإشارات أثناء تكوين الجنين عن طريق زرع مصادر الإشارات خارج الرحم. كما أنه يسهل توليد كفاءة من المسوخ الجرثومية. يمكن تطبيق البروتوكول على خشبة البحر الوحشي المرحلة blastula وأجنة ميداكا، وربما أيضا إلى المراحل الجنينية الأخرى والأنواع TDO.لتجميع جهاز زرع، وربط تلميح إغراء 25 ميكرولتر الغاز حقنة ضيقة لحامل ماصة صغيرة باستخدام تركيب قفل إغراء. ثم قم بتركيب الجهاز مباشرة على مناور صغير يدوي. لاستخدام جهاز الزرع، ضع المتلاعب الصغير مع الجهاز المجمع بجوار مجهر ستيريو.ثم إزالة المكبس وإدراج إبرة زرع. خفض الإبرة في طبق مملوء محلول رينغر في زاوية 45 درجة حتى يتم غمر غيض من الإبرة. أدخل المكبس في منتصف الطريق تقريبا لطرد حلول Ringer ، تاركا كمية صغيرة فقط من الماء في الجزء الرقيق من الإبرة.عند استخدام إبرة زرع للمرة الأولى، معطف داخل الإبرة عن طريق رسم نير من الجنين التضحية وطرد المواد نير تماما. بعد ذلك ، باستخدام إبرة زرع ، ضع الجنين المتبرع برفق ، ثم ضع الإبرة التي تفتح متعامدة على سطح الجنين واسحب المكبس بعناية لرسم الخلايا في الإبرة. بمجرد سحب العدد المطلوب من الخلايا ، أوقف الشفط عن طريق دفع المكبس برفق إلى الأسفل وإزالة الإبرة من الجنين عن طريق الرجيج الإبرة إلى الجانب في حركة قصيرة وسريعة.اترك محلول Ringer على جانبي عمود الخلية عن طريق تقييد الخلايا إلى نهاية الإبرة المدببة. مسح أي صفار المتبقية أو حطام الخلية عن طريق تحريك ببطء المكبس صعودا وهبوطا وغسل الخلايا مع محلول رينغر. بعد ذلك ، قم بتحريك طبق الزرع بيد غير مهيمنة لوضع الإبرة المتعامدة على سطح الجنين المضيف.تطبيق ضغط طفيف على الجنين عن طريق الضغط بعناية على الجدران. ثم مع حركة حادة سريعة ، اخترق الطبقة المغلفة للجنين المضيف مع الحرص على عدم خدش الصفار بالإبرة. بمجرد أن تدخل الإبرة ، ادفع المكبس برفق لقذف عمود الخلايا في الجنين ، وتراجع الإبرة ببطء في وقت واحد.لزرع الخلايا الجرثومية، وملء طبق زرع مع محلول رينغر، ثم نقل الكرة dechorionated إلى الأجنة مرحلة القبة في طبق زرع ووضع الأجنة المضيف والمانح في أعمدة بالتناوب لزرع الخلايا من جنين متبرع واحد إلى ستة أجنة مضيفة مختلفة. لتنفيذ عملية الزرع، توجيه الأجنة مع الهامش نحو إبرة زرع. لزرع الجرثومة، خذ الخلايا المصدر من الهامش وأودعها في نفس الموقع في الجنين المضيف.بمجرد الانتهاء من عملية الزرع، اسمح للجنين بالتعافي في محلول رينغر لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. ثم باستخدام مجهر ستيريو مضان، فحص الخلايا المزروعة. بعد ذلك ، نقل الأجنة إلى 24 طبق مغلفة Agarose جيدا مع الجنين المتوسط تجميع جميع الأجنة المضيفة التي تلقت خلايا من نفس المتبرع في نفس البئر.ثم احتضان الأجنة في 28 درجة مئوية حتى اليوم التالي. إذا لزم الأمر، نقل الأجنة المانحة إلى شرائط PCR المسمى لل genotyping. بعد 30 ساعة من الإخصاب، قم بفحص الأجنة المضيفة لإجراء عمليات زرع الجرثومة الناجحة تحت مجهر ستيريو مضان.يجب أن تكون الخلايا الجرثومية موجودة في الأخدود فوق امتداد الصفار. زراعة اليرقة المزروعة بنجاح إلى غطاء محرك السيارة للبالغين وفقا لظروف تربية قياسية. في عمليات الزرع الناجحة ، يبدو الجنين طبيعيا ومشابها في الشكل ووضوح الصفار للأجنة غير المخططة دون دموع كبيرة في blastoderm.في المقابل، إذا كان الجنين معطوبا بشكل واضح أثناء الزرع، فلن يتطور بشكل طبيعي. على الرغم من أن جهاز الزرع قد استخدم بشكل رئيسي على أجنة حمار وحشي في مراحل blastula ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء الزرع وإزالة الخلايا في أجنة مرحلة blastula dechorionated من ميداكا سمك الأرز الياباني. في حالة زرع الجرثومة على وجه التحديد ، ينتج عن زرع جيد جنين مع عمود أفقي طويل من الخلايا فوق هامش الصفار مباشرة.ومع ذلك ، لا يمكن تقييم نجاح الإجراء إلا بعد 24 إلى 30 ساعة من الإخصاب عندما تكون الخلايا الجرثومية متميزة في مضانها عن الخلايا الجسدية. ستظهر الخلايا الجرثومية البدائية كمجالات فلورية صغيرة في الأخدود مباشرة فوق امتداد الصفار. وجود هذه الخلايا الجرثومية في الموقع الصحيح يشير إلى نجاح زرع الجرثومة.وترد هنا أمثلة على عمليات زرع غير ناجحة. في المثال الأول ، على الرغم من أن الخلايا الجرثومية قد وصلت إلى ميسودرم غدد الغدد التناسلية ، حيث أن الجنين المضيف مشوه بشدة ، إلا أنه لن يتطور بشكل طبيعي. في المثال الثاني، يتم الكشف عن الخلايا الفلورية فقط خارج الأخدود.هذه الخلايا هي إما خلايا جسدية أو خلايا جرثومية فشلت في الهجرة بشكل صحيح. وكلا النوعين من الخلايا لن يساهم في الخط الجرثومي للجنين. من المهم تجنب تلف الخلايا المزروعة والجنين المضيف.يجب رسم الخلايا ببطء، وتطهيرها من أي صفار المتبقية، ويتم إدراجها بعناية. توفر هذه الطريقة طريقة سهلة لزرع الخلايا في أجنة حمار وحشي ، وستكون مفيدة لتوليد مصادر خارج الرحم ومسوخ الجرثومة. الميزة الرئيسية لهذا الجهاز، فمن تكلفة منخفضة، والكثير ويستخدم.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

تعديل التزجيج MicroSecure: وفعالة للغاية إجراء الحفظ بالتبريد آمنة وبسيطة والكيسات الأريمية الإنسان

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...