Name: a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos at JoVE.com

Ce projet a été soutenu par la Société Max Planck et a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 637840 (QUANTPATTERN) et convention de subvention n° 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol>
	<li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species.">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li><li>M&#252;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system.">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li><li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion.">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li><li>Pomreinke, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BMP+signaling+and+distribution+during+zebrafish+dorsal-ventral+patterning.">Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning.</a> eLife. 6, 25861 (2017).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signaling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Soh, G. H., Pomreinke, A. P., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Nodal+and+BMP+signaling+by+mutual+signaling+effector+antagonism.">Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism.</a> Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).</li><li>Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+reorganization+of+xanthophores+fine-tunes+and+colors+the+striped+pattern+of+zebrafish.">Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish.</a> Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).</li><li>Frohnh&#246;fer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridophores+and+their+interactions+with+other+chromatophores+are+required+for+stripe+formation+in+zebrafish.">Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish.</a> Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).</li><li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen.">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li><li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germline+replacement.">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).</li><li>Capek, D., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration.">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), 177709 (2019).</li><li>Rogers, K. W., Bl&#228;&#223;le, A., Schier, A. F., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+stability+in+living+zebrafish+embryos+using+fluorescence+decay+after+photoconversion+(FDAP).">Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).</li><li>Carvalho, L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yolk+syncytial+layer+in+early+zebrafish+development.">The yolk syncytial layer in early zebrafish development.</a> Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).</li><li>Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+of+medaka+embryos+and+cell+transplantation+for+the+generation+of+chimeras.">Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).</li><li>Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+and+multipotency+in+retinal+stem+cells.">Fate restriction and multipotency in retinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le succès d’une expérience de transplantation repose fortement sur la motricité fine de l’expérimentateur. Pour mener à bien les procédures, la pratique est nécessaire. Cependant, l’instrument présenté ici est relativement facile à apprendre et à utiliser par rapport à d’autres sur le marché et, en général, seulement quelques jours de pratique sont nécessaires.
Le succès de la procédure de transplantation peut être amélioré en prenant plusieurs précautions. Une étape consiste à s’assurer que le micromanipulateur est de bonne qualité et capable de fonctionner en douceur. L’ajout d’une oculaire avec un grossissement plus élevé au stéréomicroscope peut aider à positionner précisément l’aiguille par rapport à l’embryon. L’utilisation de poissons-zèbres ou de medaka bien reproducteurs pour acquérir des embryons sains et en prenant soin de ne pas endommager les embryons pendant la manipulation (en particulier pendant et après l’étape de déchorionation) augmentera également le taux de réussite.
Les problèmes de toxicité retardée peuvent être plus difficiles à résoudre. Si un embryon meurt après quelques heures - mais pas immédiatement après la transplantation - le jaune peut avoir été endommagé par l’aiguille (par exemple, en entrant trop profondément dans l’embryon), ou peut-être que les cellules ont été éjectées trop fort. Une toxicité retardée et la mort embryonnaire peuvent également résulter de l’injection de jaune ou de débris cellulaires avec les cellules donneuses; une autre cause peut être la détérioration du tampon HEPES dans la solution de Ringer. Ces problèmes peuvent être surmontés en lavant les cellules (voir étape 1.3.8) ou simplement en utilisant un nouveau lot de tampon, respectivement. En outre, les embryons hôtes déformés dans les expériences de transplantation germinale pourraient résulter de concentrations excessivement élevées de morpholino. Il est crucial d’utiliser suffisamment de morpholino pour ablation complète de la lignée germinale de type sauvage de l’hôte, empêchant ainsi ces cellules de contribuer à la progéniture - mais en même temps, des concentrations excessivement élevées de morpholino doivent être évitées. Des quantités constantes de morpholino sur tous les embryons hôtes injectés (quelques centaines dans une expérience typique) sont donc la clé du succès des transplantations germinales. Cela peut être facilité en complétant le mélange d’injection de morpholino avec un colorant traceur facilement visible14, qui peut être suivi sous un stéréomicroscope à fluorescence pour s’assurer que tous les embryons reçoivent le même volume d’injection.
Les procédures décrites dans ce protocole impliquent exclusivement des manipulations de cellules dans des embryons de poisson-zèbre ou de médaka au stade de blastula, mais à l’avenir, il sera probablement possible d’adapter le dispositif à différents stades et espèces en modifiant le diamètre et la forme de l’aiguille de transplantation.

À partir des expériences classiques de Mangold et Spemann qui ont démontré l’existence d’un organisateur instruisant la formation d’un axe embryonnaire1, la transplantation de cellules entre embryons est devenue une technique établie pour étudier le développement embryonnaire2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Une configuration couramment utilisée pour la transplantation consiste en une seringue étanche aux gaz contrôlée par un micromètre et contrôlée par un lecteur reliée à un porte-micropipette à travers un tube flexible et un réservoir rempli d’huile minérale12,13. Dans cette configuration, le piston de la seringue est déplacé à travers une vis. La pression générée de cette manière est transférée à la micropipette et utilisée pour extraire les cellules d’un embryon et les déposer dans un autre. Cependant, ce dispositif à commande hydraulique se compose de nombreuses pièces et est laborieux à assembler à partir de zéro. Des appareils similaires peuvent également être achetés en tant qu’ensemble de travail complet, généralement vendus sous forme de micro-injecteurs manuels, et ces versions commerciales coûtent généralement plus de 1500 USD. Dans la version maison et la version commerciale, la micropipette pour la manipulation d’embryons est séparée du dispositif générateur de pression (la seringue étanche aux gaz) à travers un tube rempli d’huile. La manipulation de la micropipette et le mouvement du piston doivent donc être utilisés séparément avec des mains différentes, ce qui réduit le débit et l’utilité. De plus, les appareils sont encombrants à préparer pour la transplantation car le tube doit être soigneusement rempli d’huile tout en évitant la formation de bulles. Ici, nous décrivons un dispositif alternatif à commande pneumatique pour l’élimination et la transplantation de cellules qui est peu coûteux, facile à assembler et simple à utiliser.
L’appareil présenté ici comprend une seringue étanche aux gaz de 25 μL équipée d’un porte-micropipette et coûte moins de 80 US$ au total. L’appareil est facilement assemblé en insérant le porte-micropipette dans la seringue via le raccord de verrouillage Luer (Figure 1A). L’appareil est ensuite directement monté sur un micromanipulateur, ce qui permet à l’utilisateur de contrôler à la fois sa position et l’aspiration d’une seule main directement sur le micromanipulateur. Cela laisse commodément l’autre main libre pour stabiliser et déplacer le plat de transplantation contenant des embryons de donneurs et d’hôtes. L’appareil fonctionne par aspiration directe avec de l’air et n’a pas besoin d’être rempli d’huile minérale. En raison des forces d’attraction entre l’eau et les parois de l’aiguille en verre, un grand mouvement dans le piston de la seringue se traduit par un mouvement plus petit dans le niveau d’eau à l’intérieur de l’aiguille, tant que le niveau d’eau est dans l’extrémité effilée de l’aiguille en verre. Cela permet un contrôle précis du nombre de cellules aspirées et de l’emplacement de leur insertion.
Pour démontrer l’utilité de ce dispositif, nous présentons trois applications dans les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio). Tout d’abord, nous montrons comment générer des sources localisées de molécules de signalisation sécrétées, qui peuvent être utilisées pour étudier la formation de gradient2,4,6. Ici, les embryons de donneurs sont injectés avec de l’ARNm codant pour une molécule de signalisation marquée par fluorescence. Les cellules donneuses marquées par fluorescence sont ensuite transplantées sur des embryons hôtes de type sauvage où la formation d’un gradient de signal peut être imagée et analysée. Deuxièmement, nous décrivons comment le dispositif peut être utilisé pour éliminer des cellules par extirpation afin de générer des embryons de taille réduite5,13. Enfin, nous montrons comment produire de manière robuste des mutants maternels-zygotiques en transplantant des cellules porteuses d’un rapporteur de cellules germinales primordiales dans des embryons hôtes dans lesquels la lignée germinale avait été ablation6,10. À l’avenir, le dispositif de transplantation décrit ici pourra être facilement adapté à d’autres manipulations embryologiques nécessitant le retrait ou la transplantation de cellules.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mm glass capillary, ends cut without filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mL glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To coat plastic dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnd1 morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC 
			CAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To assess YSL injections and germ-line transplantations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Kimble Chase (via Fisher)</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator at 28 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer tip 25 &#956;L Hamilton syringe, 1700 series</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Ref: 80201</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator with 3 axes of movement</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For controlling the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual pipetting pump</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>Cat. # 641</td>
			<td>For use with the glass pipettes to transfer embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For moving and rotating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF2</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and morpholino into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds, triangular grooves</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare microinjection plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection-molds, single wells</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>To prepare transplantation plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH6S10</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 
			transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340M</td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid with GFP-nos1 3&#39;UTR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3&#39;UTR of nos1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dish 100 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td>For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection and transplantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos

Les manipulations embryologiques classiques, telles que l’élimination des cellules et la transplantation de cellules à l’intérieur ou entre les embryons, sont des techniques puissantes pour étudier des processus de développement complexes. Les embryons de poisson-zèbre sont parfaitement adaptés à ces manipulations car ils sont facilement accessibles, de taille relativement grande et transparents. Cependant, les dispositifs précédemment développés pour l’élimination et la transplantation de cellules sont lourds à utiliser ou coûteux à l’achat. En revanche, le dispositif de transplantation présenté ici est économique, facile à assembler et simple à utiliser. Dans ce protocole, nous introduisons d’abord la manipulation du dispositif de transplantation ainsi que son assemblage à partir de pièces commerciales et largement disponibles. Nous présentons ensuite trois applications pour son utilisation : la génération de clones ectopiques pour étudier la dispersion du signal à partir de sources localisées, la disparition de cellules pour produire des embryons de taille réduite et la transplantation germinale pour générer des mutants maternels-zygotiques. Enfin, nous montrons que l’outil peut également être utilisé pour des manipulations embryologiques chez d’autres espèces telles que le poisson de riz japonais medaka.

Le succès et l’échec dans l’utilisation du dispositif de transplantation pour les trois applications décrites ci-dessus peuvent facilement être évalués par inspection visuelle sous stéréomicroscope. Dans les transplantations réussies, l’embryon doit avoir l’air normal et similaire en forme et en clarté du jaune aux embryons non transplantés, sans grandes déchirures dans le blastoderme. Si l’embryon est visiblement endommagé (Figure 4B), il ne se développera pas normalement. Idéalement, les cellules transplantées exprimant un marqueur fluorescent devraient apparaître sous la forme d’une colonne continue lorsqu’elles sont visualisées sous un stéréomicroscope à fluorescence (Figure 2A, Figure 4A). Si la colonne est fragmentée, cela indique que les cellules ont été cisaillées par l’aspiration dans l’aiguille de transplantation ou que le dépôt des cellules a été fait trop vigoureusement. Cela peut être évité en déplaçant le piston plus lentement et plus doucement.
Bien que le dispositif de transplantation ait été principalement utilisé sur des embryons de poisson-zèbre au stade de blastula5,6, la transplantation et la disparition de cellules fonctionnent tout aussi bien pour les embryons de stade blastula décononnés du poisson de riz japonais medaka (Oryzias latipes) (Figure 2B). En dehors de la déséchorionation embryonnaire, qui a été décrite par Porazinski, S. R. et al.17, les mêmes procédures que celles décrites ci-dessus peuvent être suivies.
Dans le cas spécifique de la transplantation germinale, une bonne greffe aboutira à un embryon avec une longue colonne horizontale de cellules directement au-dessus de la marge du jaune (Figure 4A). Cependant, la question de savoir si les cellules germinales ont été transplantées avec succès ne peut être évaluée que le lendemain (figure 4C-F) en raison de l’expression de fond de la GFP aux stades de blastula (figure 1F). Les cellules germinales primordiales apparaîtront sous forme de petites sphères fluorescentes dans le sillon directement au-dessus de l’extension du jaune (Figure 4C-E). La présence de ces cellules au bon endroit indique une transplantation germinale réussie. Les cellules de forme différente ne sont pas des cellules germinales (p. ex., les cellules allongées sont généralement des cellules musculaires, figure 4F). De plus, si les cellules germinales primordiales se trouvent à l’extérieur du sillon, cela signifie qu’elles n’ont pas migré correctement et qu’elles ne pourront pas contribuer à la lignée germinale de l’embryon. Enfin, la morphologie générale des embryons transplantés devrait ressembler à celle des embryons non transplantés (figure 4D); la queue ne doit pas être déformée et la tête ne doit pas être rétrécie ou les yeux manquants (figure 4E). Ces défauts résultent généralement de concentrations excessivement élevées de morpholino ou de lésions embryonnaires lors de la transplantation. Les expériences de transplantation germinale décrites ici aboutiront généralement à 1-2 embryons hôtes sur 6 avec des cellules germinales transplantées avec succès pour 60% à 80% des embryons de donneurs, selon l’expérience de l’expérimentateur. Ainsi, les cellules de 40 à 50 embryons de donneurs homozygotes doivent être transplantées dans 200 à 300 embryons hôtes pour élever environ 30 individus avec des cellules germinales mutantes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> Figure 1 : Assemblage et utilisation du dispositif de transplantation. (A) Le dispositif de transplantation est assemblé en connectant une seringue étanche aux gaz avec un porte-micropipette via le raccord de verrouillage Luer. L’aiguille en verre pour la transplantation est ensuite insérée dans le support de la micropipette. (B) Photographie du dispositif de transplantation assemblé monté sur un micromanipulateur (veuillez noter que l’arrière-plan et les étiquettes ont été retirés de l’image). (C) Lors de l’utilisation du dispositif de transplantation, il est important de s’assurer que le niveau d’eau dans l’aiguille de transplantation reste à l’extrémité effilée. D) Le dispositif est utilisé sous stéréomicroscope pour prélever et insérer des cellules de et dans des embryons de téléostéens placés dans des puits individuels d’une boîte de transplantation. (E) Pour la génération de sources ectopiques, les cellules sont prélevées sur le pôle animal d’un embryon donneur (i-ii) et transférées dans le pôle animal d’un embryon hôte (iii-vi). (F) Pour la transplantation germinale, un plus grand nombre de cellules est prélevé dans la marge d’un embryon donneur (i-ii), où se trouvent les cellules germinales. Les cellules sont ensuite transférées dans la marge des embryons hôtes (iii-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> Figure 2: Génération de clones par transplantation cellulaire. (A) Exemple d’un double clone généré par transplantation séquentielle de cellules fluorescentes (vert) d’un donneur de poisson zèbre dans un embryon hôte de poisson-zèbre. Des clones simples et doubles peuvent être utilisés pour étudier comment les molécules de signalisation sécrétées forment des gradients spatio-temporels2,4,5,6. (B) Exemple d’un clone unique généré par la transplantation de cellules d’un donneur de medaka transgénique exprimant l’eGFP (Wimbledon)17 dans un hôte medaka de type sauvage. Les barres d’échelle représentent 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> Figure 3 : Génération d’embryons de taille réduite par extirpation cellulaire. (A) Avant de prélever des cellules par extirpation, le YSL peut être marqué en injectant des colorants fluorescents dans deux côtés opposés du YSL. (B) Exemple d’embryon après injection de YSL. (C) Pour générer des embryons de taille réduite, les cellules du pôle animal sont retirées par extirpation5. D) Exemple d’embryon après disparition de cellule. Notez que le YSL reste intact. Les barres d’échelle représentent 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> Figure 4 : Transplantation germinale. (A) Exemple de transplantation réussie de cellules donneuses (vert) dans la zone marginale de l’hôte. (B) Exemple d’une transplantation infructueuse. Le jaune de l’embryon hôte a été gravement endommagé et l’embryon ne pourra pas se développer normalement. (C) À 30 hpf, les cellules germinales transplantées avec succès se trouveront uniquement dans le mésoderme gonadique de la région antérieure de l’extension du jaune. (D) Exemple d’une transplantation réussie dans laquelle plusieurs cellules germinales de donneurs marquées GFP ont peuplé la future gonade de l’hôte. (E) Exemple d’une transplantation infructueuse. Bien que les cellules germinales aient atteint le mésoderme gonadique, l’embryon hôte est gravement déformé et ne se développera pas normalement. (F) Exemple d’une transplantation infructueuse. Les cellules germinales fluorescentes qui n’ont pas migré au bon endroit ne repeupleront pas les gonades. Les barres d’échelle représentent 100 μm. Les images en D-F ont été prises avec un grossissement total d’environ 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Les manipulations embryologiques telles que la disparition et la transplantation de cellules sont des outils importants pour étudier le développement précoce. Ce protocole décrit un dispositif de transplantation simple et efficace pour effectuer ces manipulations chez des embryons de poisson zèbre.

Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

La technique permet d’étudier la fonction et la gamme des molécules de signalisation au cours de l’embryogenèse en transplantant des sources de signalisation ectopiques. Il facilite également la génération efficace de mutants de la lignée germinale. Le protocole peut être appliqué aux embryons de poisson-zèbre et de medaka au stade blastula, et probablement aussi à d’autres stades embryonnaires et à des espèces de TDO.Pour assembler le dispositif de transplantation, connectez une seringue étanche au gaz à pointe de leurre de 25 microlitres à un porte-pipette à l’aide du raccord de verrouillage du leurre. Ensuite, montez l’appareil directement sur un micro-manipulateur manuel. Pour utiliser le dispositif de transplantation, placez le micro-manipulateur avec le dispositif assemblé à côté d’un stéréomicroscope.Retirez ensuite le piston et insérez l’aiguille de transplantation. Abaissez l’aiguille dans un plat rempli de solution de Ringer à un angle de 45 degrés jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit immergée. Insérez le piston environ à mi-chemin pour rincer les solutions du Ringer, en ne laissant qu’un petit volume d’eau dans la fine partie effilée de l’aiguille.Lorsque vous utilisez une aiguille de transplantation pour la première fois, enduisez l’intérieur de l’aiguille en tirant le joug d’un embryon sacrifié et en expulsant complètement le matériau du joug. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de transplantation, positionnez doucement l’embryon donneur, puis positionnez l’ouverture orthogonale de l’aiguille à la surface de l’embryon et tirez soigneusement le piston pour attirer les cellules dans l’aiguille. Une fois que le nombre souhaité de cellules est aspiré, arrêtez l’aspiration en poussant doucement le piston vers le bas et retirez l’aiguille de l’embryon en secouant l’aiguille sur le côté dans un mouvement court et rapide.Laissez une solution de Ringer de chaque côté de la colonne cellulaire en limitant les cellules à l’extrémité effilée de l’aiguille. Éliminez tout jaune ou débris cellulaire restant en déplaçant lentement le piston de haut en bas et en lavant les cellules avec la solution de Ringer. Ensuite, déplacez le plat de transplantation avec la main non dominante pour positionner l’aiguille orthogonale à la surface de l’embryon hôte.Appliquez une légère pression sur l’embryon en le pressant soigneusement contre les parois. Ensuite, avec un mouvement rapide et net, percez la couche enveloppante de l’embryon hôte en prenant soin de ne pas gratter le jaune avec l’aiguille. Une fois l’aiguille à l’intérieur, poussez doucement le piston pour extruder la colonne de cellules dans l’embryon et rétractez lentement l’aiguille simultanément.Pour la transplantation de cellules germinales, remplissez une boîte de transplantation avec la solution de Ringer, puis transférez la sphère déschorionée aux embryons au stade du dôme dans la boîte de transplantation et positionnez les embryons hôtes et donneurs dans des colonnes alternées pour transplanter les cellules d’un embryon donneur à six embryons hôtes différents. Pour effectuer la transplantation, orientez les embryons avec la marge vers l’aiguille de transplantation. Pour la transplantation germinale, prélevez les cellules sources de la marge et déposez-les au même endroit dans l’embryon hôte.Une fois la transplantation terminée, laissez l’embryon récupérer dans la solution de Ringer pendant 30 minutes à une heure. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence, examinez les cellules transplantées. Ensuite, transférez les embryons dans une plaque enduite d’agarose de 24 puits avec un milieu embryonnaire regroupant tous les embryons hôtes qui ont reçu des cellules du même donneur dans le même puits.Ensuite, incubez les embryons à 28 degrés Celsius jusqu’au lendemain. Si nécessaire, transférez les embryons du donneur dans des bandelettes PCR étiquetées pour le génotypage. 30 heures après la fécondation, dépister les embryons hôtes pour des greffes germinales réussies sous un stéréomicroscope à fluorescence.Les cellules germinales doivent être présentes au niveau de la rainure au-dessus de l’extension du jaune. Cultiver la larve transplantée avec succès sur le capuchon adulte selon les conditions d’élevage standard. Dans les transplantations réussies, l’embryon semble normal et similaire en forme et en clarté du jaune aux embryons non transplantés sans grandes déchirures dans le blastoderme.En revanche, si un embryon est visiblement endommagé pendant la transplantation, il ne se développera pas normalement. Bien que le dispositif de transplantation ait été principalement utilisé sur des embryons de poisson zèbre au stade de blastula, la transplantation et l’extirpation cellulaire peuvent également être effectuées dans des embryons de stade de blastula décononnés du poisson de riz japonais medaka. Dans le cas spécifique de la transplantation germinale, une bonne transplantation aboutit à un embryon avec une longue colonne horizontale de cellules directement au-dessus de la marge du jaune.Cependant, le succès de la procédure ne peut être évalué qu’après 24 à 30 heures de fécondation lorsque les cellules germinales sont distinctes dans leur fluorescence des cellules somatiques. Les cellules germinales primordiales apparaîtront sous forme de petites sphères fluorescentes dans le sillon directement au-dessus de l’extension du jaune. La présence de ces cellules germinales au bon endroit indique une transplantation germinale réussie.Des exemples de transplantations infructueuses sont présentés ici. Dans le premier exemple, bien que les cellules germinales aient atteint le mésoderme gonadique, car l’embryon hôte est gravement déformé, il ne se développera pas normalement. Dans le deuxième exemple, les cellules fluorescentes ne sont détectées qu’à l’extérieur du sillon.Ces cellules sont soit des cellules somatiques, soit des cellules germinales qui n’ont pas migré correctement. Et les deux types de cellules ne contribueront pas à la lignée germinale de l’embryon. Il est essentiel d’éviter d’endommager les cellules transplantées et l’embryon hôte.Les cellules doivent être dressées lentement, éliminées de tout jaune restant et être insérées avec soin. Cette méthode fournit un moyen facile de transplanter des cellules dans des embryons de poisson zèbre et sera utile pour générer des sources ectopiques et des mutants germinaux. Le principal avantage de cet appareil, il est peu coûteux, et est beaucoup et utilise.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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