Name: a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos at JoVE.com

Questo progetto è stato sostenuto dalla Max Planck Society e ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 637840 (QUANTPATTERN) e convenzione di sovvenzione n. 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol>
	<li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species.">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li><li>M&#252;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system.">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li><li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion.">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li><li>Pomreinke, A. 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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Il successo di un esperimento di trapianto si basa fortemente sulle capacità motorie dello sperimentatore. Per eseguire con successo le procedure, è necessaria la pratica. Tuttavia, lo strumento qui presentato è relativamente facile da imparare e utilizzare rispetto ad altri sul mercato e, in generale, sono necessari solo pochi giorni di pratica.
Il successo della procedura di trapianto può essere migliorato prendendo diverse precauzioni. Un passo è garantire che il micromanipolatore sia di buona qualità e in grado di funzionare senza intoppi. L'aggiunta di un oculare con ingrandimento più elevato allo stereomicroscopio può aiutare a posizionare con precisione l'ago rispetto all'embrione. L'uso di zebrafish o medaka ben allevati per acquisire embrioni sani e fare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante la manipolazione (specialmente durante e dopo la fase di decoriorazione) migliorerà anche il tasso di successo.
I problemi con la tossicità ritardata possono essere più difficili da risolvere. Se un embrione muore dopo poche ore - ma non immediatamente dopo il trapianto - il tuorlo potrebbe essere stato danneggiato dall'ago (ad esempio, entrando nell'embrione troppo in profondità), o forse le cellule sono state espulse con troppa forza. La tossicità ritardata e la morte embrionale possono anche derivare da tuorlo o detriti cellulari iniettati insieme alle cellule donatrici; un'altra causa può essere il deterioramento del buffer HEPES nella soluzione di Ringer. Questi problemi possono essere superati lavando le celle (vedi punto 1.3.8) o semplicemente utilizzando un nuovo lotto di tampone, rispettivamente. Inoltre, gli embrioni ospiti deformati negli esperimenti di trapianto germinale potrebbero derivare da concentrazioni di morfolino eccessivamente elevate. È fondamentale utilizzare abbastanza morfolino per ablare completamente la linea germinale selvatica dell'ospite, impedendo così a queste cellule di contribuire alla prole - ma allo stesso tempo, è necessario evitare concentrazioni di morfolino eccessivamente elevate. Quantità consistenti di morfolino in tutti gli embrioni ospiti iniettati (poche centinaia in un esperimento tipico) sono quindi la chiave per il successo dei trapianti di linea germinale. Questo può essere aiutato integrando la miscela di iniezione di morfolino con un colorante tracciante facilmente visibile14, che può essere monitorato sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza per garantire che tutti gli embrioni ricevano lo stesso volume di iniezione.
Le procedure descritte in questo protocollo comportano esclusivamente manipolazioni di cellule in embrioni di zebrafish o medaka allo stadio di blastula, ma in futuro sarà probabilmente possibile adattare il dispositivo a diversi stadi e specie modificando il diametro e la forma dell'ago del trapianto.

Dagli esperimenti classici di Mangold e Spemann che hanno dimostrato l'esistenza di un organizzatore che istruisce la formazione di un asse embrionale1, il trapianto di cellule tra embrioni è diventato una tecnica consolidata per studiare lo sviluppo embrionale2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Una configurazione comunemente usata per il trapianto consiste in una siringa a tenuta di gas controllata da micrometri collegata a un supporto per micropipette tramite tubi flessibili e un serbatoio riempito con olio minerale12,13. In questa configurazione, lo stantuffo della siringa viene spostato attraverso una vite. La pressione generata in questo modo viene trasferita alla micropipetta e utilizzata per estrarre le cellule da un embrione e depositarle in un altro. Tuttavia, questo dispositivo azionato idraulicamente è costituito da molte parti ed è laborioso da assemblare da zero. Dispositivi simili possono anche essere acquistati come set di lavoro completo, di solito venduti come microiniettori manuali, e queste versioni commerciali in genere costano più di 1500 US $. Sia nella versione fatta in casa che in quella commerciale, la micropipetta per la manipolazione degli embrioni viene separata dal dispositivo di generazione della pressione (la siringa a tenuta di gas) attraverso tubi riempiti di olio. La manipolazione della micropipetta e il movimento dello stantuffo, quindi, devono essere azionati separatamente con mani diverse, riducendo la produttività e l'utilità. Inoltre, i dispositivi sono ingombranti da preparare per il trapianto poiché il tubo deve essere accuratamente riempito con olio evitando la formazione di bolle. Qui, descriviamo un dispositivo alternativo ad azionamento pneumatico per la rimozione e il trapianto di cellule che è economico, facile da assemblare e semplice da usare.
Il dispositivo qui presentato comprende una siringa a tenuta di gas da 25 μL dotata di un supporto per micropipette e costa complessivamente meno di 80 DOLLARI. Il dispositivo può essere facilmente assemblato inserendo il supporto della micropipetta nella siringa tramite il raccordo Luer lock (Figura 1A). Il dispositivo viene quindi montato direttamente su un micromanipolatore, consentendo all'utente di controllare sia la sua posizione che l'aspirazione con una sola mano direttamente sul micromanipolatore. Questo lascia convenientemente l'altra mano libera di stabilizzare e spostare il piatto di trapianto contenente embrioni donatori e ospiti. Il dispositivo funziona per aspirazione diretta con aria e non ha bisogno di essere riempito con olio minerale. A causa delle forze attrattive tra l'acqua e le pareti dell'ago di vetro, un grande movimento nello stantuffo della siringa si traduce in un movimento più piccolo nel livello dell'acqua all'interno dell'ago, purché il livello dell'acqua sia nell'estremità affusolata dell'ago di vetro. Ciò consente un controllo preciso sul numero di celle aspirate e sulla posizione del loro inserimento.
Per dimostrare l'utilità di questo dispositivo, presentiamo tre applicazioni negli embrioni di zebrafish (Danio rerio). In primo luogo, mostriamo come generare fonti localizzate di molecole di segnalazione secrete, che possono essere utilizzate per studiare la formazione del gradiente2,4,6. Qui, gli embrioni donatori vengono iniettati con mRNA che codifica una molecola di segnalazione marcata fluorescentemente. Le cellule donatrici marcate con fluorescenza vengono quindi trapiantate in embrioni ospiti wild-type dove la formazione di un gradiente di segnale può essere ripresa e analizzata. In secondo luogo, descriviamo come il dispositivo può essere utilizzato per rimuovere le cellule per estirpazione al fine di generare embrioni di dimensioni ridotte5,13. Infine, mostriamo come produrre in modo robusto mutanti materno-zigoti trapiantando cellule portatrici di un reporter di cellule germinali primordiali in embrioni ospiti in cui la linea germinale era stata ablatata6,10. In futuro, il dispositivo di trapianto qui descritto può essere facilmente adattato ad altre manipolazioni embriologiche che richiedono la rimozione o il trapianto di cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mm glass capillary, ends cut without filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mL glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To coat plastic dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnd1 morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC 
			CAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To assess YSL injections and germ-line transplantations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Kimble Chase (via Fisher)</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator at 28 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer tip 25 &#956;L Hamilton syringe, 1700 series</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Ref: 80201</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator with 3 axes of movement</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For controlling the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual pipetting pump</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>Cat. # 641</td>
			<td>For use with the glass pipettes to transfer embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For moving and rotating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF2</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and morpholino into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds, triangular grooves</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare microinjection plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection-molds, single wells</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>To prepare transplantation plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH6S10</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 
			transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340M</td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid with GFP-nos1 3&#39;UTR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3&#39;UTR of nos1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dish 100 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td>For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection and transplantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos

Le manipolazioni embriologiche classiche, come la rimozione di cellule e il trapianto di cellule all'interno o tra gli embrioni, sono tecniche potenti per studiare complessi processi di sviluppo. Gli embrioni di zebrafish sono ideali per queste manipolazioni poiché sono facilmente accessibili, di dimensioni relativamente grandi e trasparenti. Tuttavia, i dispositivi sviluppati in precedenza per la rimozione e il trapianto di cellule sono ingombranti da usare o costosi da acquistare. Al contrario, il dispositivo di trapianto qui presentato è economico, facile da montare e semplice da usare. In questo protocollo, introduciamo innanzitutto la manipolazione del dispositivo di trapianto e il suo assemblaggio da parti commercialmente e ampiamente disponibili. Presentiamo quindi tre applicazioni per il suo utilizzo: generazione di cloni ectopici per studiare la dispersione del segnale da fonti localizzate, estirpazione di cellule per produrre embrioni di dimensioni ridotte e trapianto germinale per generare mutanti materno-zigoti. Infine, mostriamo che lo strumento può essere utilizzato anche per manipolazioni embriologiche in altre specie come il pesce riso giapponese medaka.

Il successo e il fallimento nell'uso del dispositivo di trapianto per le tre applicazioni sopra descritte possono essere facilmente valutati mediante ispezione visiva sotto uno stereomicroscopio. Nei trapianti di successo, l'embrione dovrebbe apparire normale e simile nella forma e nella chiarezza del tuorlo agli embrioni non trapiantati, senza grandi lacrime nel blastoderma. Se l'embrione è visibilmente danneggiato (Figura 4B), non si svilupperà normalmente. Idealmente, le cellule trapiantate che esprimono un marcatore fluorescente dovrebbero apparire come una colonna continua se viste sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 2A, Figura 4A). Se la colonna è frammentata, ciò indica che le cellule sono state tranciate dall'aspirazione nell'ago del trapianto o che la deposizione delle cellule è stata eseguita troppo vigorosamente. Questo può essere evitato spostando lo stantuffo più lentamente e delicatamente.
Sebbene il dispositivo di trapianto sia stato utilizzato principalmente su embrioni di zebrafish in fase di blastula5,6, il trapianto e l'estirpazione cellulare funzionano altrettanto bene per gli embrioni decorionati allo stadio di blastula del pesce riso giapponese medaka (Oryzias latipes) (Figura 2B). Oltre alla decorionazione embrionale, che è stata descritta da Porazinski, S. R. et al.17, possono essere seguite le stesse procedure sopra descritte.
Nel caso specifico del trapianto germinale, un buon trapianto si tradurrà in un embrione con una lunga colonna orizzontale di cellule direttamente sopra il margine del tuorlo (Figura 4A). Tuttavia, se le cellule germinali sono state trapiantate con successo può essere valutato solo il giorno successivo (Figura 4C-F) a causa dell'espressione di fondo della GFP negli stadi di blastula (Figura 1F). Le cellule germinali primordiali appariranno come piccole sfere fluorescenti nel solco direttamente sopra l'estensione del tuorlo (Figura 4C-E). La presenza di queste cellule nella posizione corretta indica il successo del trapianto germinale. Le cellule con una forma diversa non sono cellule germinali (ad esempio, le cellule allungate sono tipicamente cellule muscolari, Figura 4F). Inoltre, se le cellule germinali primordiali si trovano al di fuori del solco, ciò significa che non sono riuscite a migrare correttamente e non saranno in grado di contribuire alla linea germinale dell'embrione. Infine, la morfologia generale degli embrioni trapiantati dovrebbe apparire simile agli embrioni non trapiantati (Figura 4D); la coda non deve essere deformata e la testa non deve essere rimpicciolita o manca di occhi (Figura 4E). Questi difetti derivano generalmente da concentrazioni di morfolino eccessivamente elevate o da danni agli embrioni durante il trapianto. Gli esperimenti di trapianto germinale come descritto qui si tradurranno in genere in 1-2 su 6 embrioni ospiti con cellule germinali trapiantate con successo per il 60% -80% degli embrioni donatori, a seconda dell'esperienza dello sperimentatore. Pertanto, le cellule di 40-50 embrioni donatori omozigoti devono essere trapiantate in 200-300 embrioni ospiti per allevare circa 30 individui con cellule germinali mutanti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> Figura 1: Assemblaggio e utilizzo del dispositivo di trapianto. (A) Il dispositivo di trapianto viene assemblato collegando una siringa a tenuta di gas con un supporto per micropipette tramite raccordo Luer lock. L'ago di vetro per il trapianto viene quindi inserito nel supporto della micropipetta. (B) Fotografia del dispositivo di trapianto assemblato montato su un micromanipolatore (si prega di notare che lo sfondo e le etichette sono stati rimossi dall'immagine). (C) Quando si utilizza il dispositivo di trapianto, è importante assicurarsi che il livello dell'acqua nell'ago da trapianto rimanga all'estremità affusolata. (D) Il dispositivo è utilizzato sotto uno stereomicroscopio per prelevare e inserire cellule da e verso embrioni di teleostei collocati in singoli pozzetti di una parabola da trapianto. (E) Per la generazione di sorgenti ectopiche, le cellule sono prelevate dal polo animale di un embrione donatore (i-ii) e trasferite nel polo animale di un embrione ospite (iii-vi). (F) Per il trapianto germinale, un numero maggiore di cellule viene prelevato dal margine di un embrione donatore (i-ii), dove si trovano le cellule germinali. Le cellule vengono quindi trasferite nel margine degli embrioni ospiti (iii-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> Figura 2: Generazione di cloni mediante trapianto di cellule. (A) Esempio di un doppio clone generato mediante trapianto sequenziale di cellule fluorescenti (verdi) da un donatore di zebrafish in un embrione ospite di zebrafish. Cloni singoli e doppi possono essere utilizzati per studiare come le molecole di segnalazione secrete formano gradienti spaziotemporali2,4,5,6. (B) Esempio di un singolo clone generato dal trapianto di cellule da un donatore medaka transgenico che esprime eGFP (Wimbledon)17 in un ospite medaka wild-type. Le barre di scala rappresentano 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> Figura 3: Generazione di embrioni di dimensioni ridotte mediante estirpazione cellulare. (A) Prima di rimuovere le cellule per estirpazione, l'YSL può essere etichettato iniettando coloranti fluorescenti in due lati opposti della YSL. (B) Esempio di embrione dopo iniezione di YSL. (C) Per generare embrioni di dimensioni ridotte, le cellule del polo animale vengono rimosse mediante estirpazione5. (D) Esempio di embrione dopo estirpazione cellulare. Si noti che l'YSL rimane intatto. Le barre di scala rappresentano 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> Figura 4: Trapianto germinale. (A) Esempio di trapianto riuscito di cellule donatrici (verdi) nella zona marginale dell'ospite. (B) Esempio di trapianto fallito. Il tuorlo dell'embrione ospite è stato gravemente danneggiato e l'embrione non sarà in grado di svilupparsi normalmente. (C) A 30 hpf, le cellule germinali trapiantate con successo si troveranno esclusivamente nel mesoderma gonadico nella regione anteriore dell'estensione del tuorlo. (D) Esempio di un trapianto riuscito in cui diverse cellule germinali di donatori marcate GFP hanno popolato la futura gonade dell'ospite. (E) Esempio di trapianto fallito. Sebbene le cellule germinali abbiano raggiunto il mesoderma gonadico, l'embrione ospite è gravemente deformato e non si svilupperà normalmente. (F) Esempio di trapianto fallito. Le cellule germinali fluorescenti che non sono riuscite a migrare nella posizione corretta non ripopoleranno le gonadi. Le barre della scala rappresentano 100 μm. Le immagini in D-F sono state scattate con un ingrandimento totale di circa 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

La tecnica consente di studiare la funzione e la gamma delle molecole di segnalazione durante l'embriogenesi trapiantando sorgenti di segnalazione ectopica. Facilita anche la generazione efficiente di mutanti germinali. Il protocollo può essere applicato agli embrioni di zebrafish e medaka allo stadio di blastula, e probabilmente anche ad altri stadi embrionali e specie di TDO.Per assemblare il dispositivo di trapianto, collegare una siringa a tenuta di gas da 25 microlitri a punta di esca a un supporto per micro pipetta utilizzando il raccordo di blocco dell'esca. Quindi montare il dispositivo direttamente su un micropolatore manuale. Per utilizzare il dispositivo di trapianto, posizionare il micropolatore con il dispositivo assemblato accanto a uno stereomicroscopio.Quindi rimuovere lo stantuffo e inserire l'ago da trapianto. Abbassare l'ago in un piatto riempito con la soluzione di Ringer con un angolo di 45 gradi fino a quando la punta dell'ago è immersa. Inserire lo stantuffo circa a metà strada per scovare le soluzioni del Ringer, lasciando solo un piccolo volume d'acqua nella sottile parte affusolata dell'ago.Quando si utilizza un ago da trapianto per la prima volta, rivestire l'interno dell'ago estraendo il giogo da un embrione sacrificato ed espellendo completamente il materiale del giogo. Successivamente, utilizzando un ago da trapianto, posizionare delicatamente l'embrione donatore, quindi posizionare l'apertura dell'ago ortogonale sulla superficie dell'embrione e tirare con attenzione lo stantuffo per attirare le cellule nell'ago. Una volta che il numero desiderato di cellule viene aspirato, interrompere l'aspirazione spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso e rimuovere l'ago dall'embrione scuotendo l'ago di lato in un movimento breve e rapido.Lasciare un po 'di soluzione di Ringer su entrambi i lati della colonna cellulare limitando le cellule all'estremità affusolata dell'ago. Eliminare eventuali tuorli o detriti cellulari rimanenti muovendo lentamente lo stantuffo su e giù e lavando le cellule con la soluzione di Ringer. Quindi, spostare la piastra di trapianto con la mano non dominante per posizionare l'ago ortogonale sulla superficie dell'embrione ospite.Applicare una leggera pressione sull'embrione schiacciandolo con cura contro le pareti. Quindi, con un rapido movimento brusco, perforare lo strato avvolgente dell'embrione ospite facendo attenzione a non graffiare il tuorlo con l'ago. Una volta che l'ago è all'interno, spingere delicatamente lo stantuffo per estrudere la colonna di cellule nell'embrione e lentamente ritrarre l'ago contemporaneamente.Per il trapianto di cellule germinali, riempire un piatto di trapianto con la soluzione di Ringer, quindi trasferire la sfera decorionata per gli embrioni di stadio a cupola nel piatto di trapianto e posizionare gli embrioni dell'ospite e del donatore in colonne alternate per trapiantare le cellule da un embrione donatore a sei diversi embrioni ospiti. Per effettuare il trapianto, orientare gli embrioni con il margine verso l'ago del trapianto. Per il trapianto germinale, prelevare le cellule sorgente dal margine e depositarle nella stessa posizione nell'embrione ospite.Una volta completato il trapianto, lasciare che l'embrione si riprenda nella soluzione di Ringer per 30 minuti a un'ora. Quindi, utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza, esaminare le cellule trapiantate. Successivamente, trasferire gli embrioni in una piastra rivestita di agarosio a 24 pozzetti con mezzo embrionale che raggruppa tutti gli embrioni ospiti che hanno ricevuto cellule dallo stesso donatore nello stesso pozzo.Quindi incubare gli embrioni a 28 gradi Celsius fino al giorno successivo. Se necessario, trasferire gli embrioni donatori in strisce PCR etichettate per la genotipizzazione. 30 ore dopo la fecondazione, esaminare gli embrioni ospiti per trapianti germinali di successo sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.Le cellule germinali dovrebbero essere presenti al solco sopra l'estensione del tuorlo. Coltiva la larva trapiantata con successo in cappuccio adulto secondo le condizioni di allevamento standard. Nei trapianti di successo, l'embrione sembra normale e simile nella forma e nella chiarezza del tuorlo agli embrioni non trapiantati senza grandi lacrime nel blastoderma.Al contrario, se un embrione è visibilmente danneggiato durante il trapianto, non si svilupperà normalmente. Sebbene il dispositivo di trapianto sia stato utilizzato principalmente su embrioni di zebrafish nelle fasi di blastula, il trapianto e l'estirpazione cellulare possono essere effettuati anche in embrioni di stadio di blastula decorionati del pesce riso giapponese medaka. Nel caso specifico del trapianto germinale, un buon trapianto si traduce in un embrione con una lunga colonna orizzontale di cellule direttamente sopra il margine del tuorlo.Tuttavia, il successo della procedura può essere valutato solo dopo 24-30 ore di fecondazione quando le cellule germinali sono distinte nella loro fluorescenza dalle cellule somatiche. Le cellule germinali primordiali appariranno come piccole sfere fluorescenti nel solco direttamente sopra l'estensione del tuorlo. La presenza di queste cellule germinali nella posizione corretta indica il successo del trapianto germinale.Esempi di trapianti non riusciti sono mostrati qui. Nel primo esempio, sebbene le cellule germinali abbiano raggiunto il mesoderma gonadico, poiché l'embrione ospite è gravemente deformato, non si svilupperà normalmente. Nel secondo esempio, le celle fluorescenti vengono rilevate solo al di fuori del solco.Queste cellule sono cellule somatiche o cellule germinali che non sono riuscite a migrare correttamente. Ed entrambi i tipi di cellule non contribuiranno alla linea germinale dell'embrione. È fondamentale evitare danni alle cellule trapiantate e all'embrione ospite.Le cellule devono essere estratte lentamente, essere ripulite da qualsiasi tuorlo rimanente ed essere inserite con attenzione. Questo metodo fornisce un modo semplice per trapiantare cellule in embrioni di zebrafish e sarà utile per generare fonti ectopiche e mutanti germinali. Il vantaggio principale di questo dispositivo, è a basso costo, ed è molto e utilizza.

Research

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