この技術は、異所性シグナル伝達源を移植することにより、胚発生時のシグナル伝達分子の機能と範囲を研究することを可能にする。また、生殖細胞系列変異体の効率的な生成を容易にする。このプロトコルは、ブラストラステージゼブラフィッシュおよびメダカ胚に適用することができ、おそらく他の胚段階およびTDO種にも適用することができる。
移植装置を組み立てるには、ルアーロックフィッティングを使用して、25マイクロリットルガスタイトシリンジをマイクロピペットホルダーに接続します。次に、デバイスを手動マイクロマニピュレータに直接取り付けます。移植装置を使用するには、組み立てられた装置を持つマイクロマニピュレータをステレオ顕微鏡の隣に置きます。
その後、プランジャーを取り外し、移植針を挿入します。針の先端が浸るまで、リンガーの溶液を45度の角度で満たした皿に針を下ろします。プランジャーを約半分に挿入してリンガーの溶液を洗い流し、針の細いテーパー部分に少量の水しか残さずに入れます。
移植用針を初めて使用する場合は、犠牲胚からヨークを引き出し、ヨーク材料を完全に排出して、針の内側をコーティングします。次に、移植針を使用して、ドナー胚を穏やかに配置し、次に、針開きの胚表面に直交する針を配置し、慎重にプランジャーを引き出して細胞を針に引き込む。所望の数の細胞が引き込まれたら、プランジャーを軽く押し下げて吸引を止め、短く迅速な動きで針を横にぎくしゃくして胚から針を取り除きます。
細胞を針の先細り端に制限することで、リンガーの溶液を細胞列の両側に残します。プランジャーを上下にゆっくりと動かし、リンガーの溶液で細胞を洗うことによって、残りの黄身または細胞の破片を取り除きます。次に、非支配的な手で移植皿を動かし、宿主胚の表面に直交する針を位置づける。
慎重に壁に絞ることによって、胚にわずかな圧力を適用します。その後、迅速な鋭い動きで、針で黄身を傷つけないように注意して宿主胚の包み込み層を突き刺す。針が中に入ったら、プランジャーを軽く押して細胞の柱を胚に押し出し、針を同時にゆっくりと引き込みます。
生殖細胞の移植のために、リンガーの溶液で移植皿を充填し、その後、デコリオ化された球体をドームステージ胚を移植皿に移し、宿主およびドナー胚を交互の柱に配置し、1つのドナー胚から6つの異なる宿主胚に細胞を移植する。移植を行うために、移植針に向けてマージンを持つ胚を向ける。生殖細胞移植の場合、ソース細胞をマージンから取り出し、宿主胚の同じ場所に沈着させる。
移植が完了したら、胚がリンガーの溶液中で30分から1時間回復することを可能にする。次に蛍光ステレオ顕微鏡を用いて、移植した細胞を調べる。次に、同じドナーから細胞を受け取ったすべての宿主胚を同じウェルにグループ化した胚培地を有する24の十分なアガロースコーティングプレートに胚を移す。
その後、次の日まで摂氏28度で胚をインキュベートします。必要に応じて、ドナー胚を標識PCRストリップに移してジェノタイピングを行います。受精後30時間、蛍光ステレオ顕微鏡下で生殖細胞移植を成功させるために宿主胚をスクリーニングする。
胚芽細胞は、卵黄の伸びの上の溝に存在するべきである。正常に移植された幼虫を成人フードに成長させる。移植に成功すると、胚は胚芽胚に大きな涙を流すことなく、移植されていない胚に正常で形と黄身の透明度が似ています。
対照的に、移植中に胚が目に見えて損傷した場合、正常に発達しない。この移植装置は主に胚芽期のゼブラフィッシュ胚に用いられてきたが、移植や細胞駆出は、日本の米魚メダカのデコリオネート胚期胚でも行うことができる。生殖細胞系列移植の特定の場合、良好な移植は、卵黄のマージンの真上に細胞の長い水平列を持つ胚をもたらす。
しかし、この処置の成功は、生殖細胞が体細胞との蛍光で区別される場合にのみ、受精の24〜30時間後に評価することができる。原始胚芽細胞は、黄身の伸びの真上の溝に小さな蛍光球として現れます。正しい場所でのこれらの生殖細胞の存在は、生殖細胞移植に成功したことを示す。
移植の失敗例をここに示す。最初の例では、胚細胞が性腺中胚に達しているが、宿主胚が重度に変形するにつれて、正常に発達しない。第2の例では、蛍光細胞は溝の外側でのみ検出される。
これらの細胞は、正しく移行できなかった体細胞または生殖細胞のいずれかです。そして、両方の細胞タイプは、胚の生殖細胞株に寄与しません。移植細胞および宿主胚への損傷を避けるために重要である。
細胞はゆっくりと描かれ、残りの黄身を取り除き、慎重に挿入する必要があります。この方法は、ゼブラフィッシュ胚の細胞を移植する簡単な方法を提供し、異所性源および生殖細胞系変異体を生成するのに有用であろう。この装置の主な利点は、それは低コストであり、多く、使用しています。
