Name: a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos at JoVE.com

Этот проект был поддержан Обществом Макса Планка и получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 637840 (QUANTPATTERN) и грантовое соглашение No 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol>
	<li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species.">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li><li>M&#252;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system.">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li><li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion.">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li><li>Pomreinke, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+BMP+signaling+and+distribution+during+zebrafish+dorsal-ventral+patterning.">Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning.</a> eLife. 6, 25861 (2017).</li><li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signaling.">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li><li>Soh, G. H., Pomreinke, A. P., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Nodal+and+BMP+signaling+by+mutual+signaling+effector+antagonism.">Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism.</a> Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).</li><li>Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+reorganization+of+xanthophores+fine-tunes+and+colors+the+striped+pattern+of+zebrafish.">Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish.</a> Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).</li><li>Frohnh&#246;fer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iridophores+and+their+interactions+with+other+chromatophores+are+required+for+stripe+formation+in+zebrafish.">Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish.</a> Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).</li><li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen.">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li><li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germline+replacement.">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).</li><li>Capek, D., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration.">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), 177709 (2019).</li><li>Rogers, K. W., Bl&#228;&#223;le, A., Schier, A. F., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+stability+in+living+zebrafish+embryos+using+fluorescence+decay+after+photoconversion+(FDAP).">Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).</li><li>Carvalho, L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yolk+syncytial+layer+in+early+zebrafish+development.">The yolk syncytial layer in early zebrafish development.</a> Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).</li><li>Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+of+medaka+embryos+and+cell+transplantation+for+the+generation+of+chimeras.">Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).</li><li>Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+and+multipotency+in+retinal+stem+cells.">Fate restriction and multipotency in retinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Успех эксперимента по трансплантации в значительной степени зависит от мелкой моторики экспериментатора. Для успешного проведения процедур требуется практика. Однако представленный здесь инструмент относительно прост в освоении и использовании по сравнению с другими на рынке, и, в целом, требуется всего несколько дней практики.
Успех процедуры трансплантации можно повысить, приняв несколько мер предосторожности. Одним из шагов является обеспечение того, чтобы микроманипулятор был хорошего качества и мог бесперебойно работать. Добавление окуляра с более высоким увеличением к стереомикроскопу может помочь точно расположить иглу относительно эмбриона. Использование хорошо размножающихся рыбок данио или медаки для приобретения здоровых эмбрионов и забота о том, чтобы не повредить эмбрионы во время обработки (особенно во время и после этапа дехорионации), также повысит вероятность успеха.
Проблемы с отсроченной токсичностью могут быть более трудными для устранения. Если эмбрион умирает через несколько часов, но не сразу после трансплантации, желток мог быть поврежден иглой (например, при слишком глубоком проникновении эмбриона), или, возможно, клетки были выброшены слишком сильно. Отсроченная токсичность и эмбриональная смерть также могут быть результатом желтка или клеточного мусора, вводимого вместе с донорскими клетками; другой причиной может быть ухудшение буфера HEPES в растворе Рингера. Эти проблемы могут быть преодолены путем промывки клеток (см. шаг 1.3.8) или просто с использованием свежей партии буфера, соответственно. Кроме того, деформированные эмбрионы-хозяева в экспериментах по трансплантации зародышевой линии могут быть результатом чрезмерно высоких концентраций морфолино. Крайне важно использовать достаточное количество морфолино, чтобы полностью абляция зародышевой линии дикого типа хозяина, тем самым предотвращая вклад этих клеток в потомство, но в то же время необходимо избегать чрезмерно высоких концентраций морфолино. Таким образом, последовательное количество морфолино во всех введенных эмбрионах-хозяевах (несколько сотен в типичном эксперименте) является ключом к успеху трансплантации зародышевой линии. Этому можно помочь, дополнив инъекционную смесь морфолино легко видимым индикаторным красителем14, который можно отслеживать под флуоресцентным стереомикроскопом, чтобы гарантировать, что все эмбрионы получают одинаковый объем инъекции.
Процедуры, описанные в этом протоколе, включают исключительно манипуляции с клетками у рыбок данио или эмбрионов медаки на стадии бластулы, но в будущем, вероятно, можно будет адаптировать устройство к различным стадиям и видам, изменив диаметр и форму иглы для трансплантации.

Из классических экспериментов Мангольда и Спемана, продемонстрировавших существование организатора, инструктирующего формирование эмбриональной оси1, трансплантация клеток между эмбрионами стала устоявшейся методикой изучения эмбрионального развития2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Широко используемая установка для трансплантации состоит из газонепроницаемого шприца с микрометровым приводом, соединенного с держателем микропипетки через гибкую трубку и резервуара, заполненного минеральным маслом12,13. В этой установке плунжер шприца перемещается через винт. Давление, создаваемое таким образом, переносится в микропипетку и используется для извлечения клеток из одного эмбриона и откладывания их в другой. Однако это устройство с гидравлическим приводом состоит из множества деталей и трудоемко собирается с нуля. Подобные устройства также можно приобрести в виде полного рабочего комплекта, обычно продаваемого как ручные микроинжекторы, и эти коммерческие версии обычно стоят более 1500 долларов США. Как в самодельном, так и в коммерческом варианте микропипетка для манипуляций с эмбрионами отделена от устройства, генерирующего давление (газонепроницаемого шприца) через маслонаполненную трубку. Манипуляции с микропипеткой и движение плунжера, следовательно, должны управляться отдельно разными руками, уменьшая пропускную способность и полезность. Кроме того, устройства громоздки для подготовки к трансплантации, так как трубки должны быть тщательно заполнены маслом, избегая образования пузырьков. Здесь мы описываем альтернативное пневматическое устройство для удаления и трансплантации клеток, которое является недорогим, простым в сборке и простым в использовании.
Представленное здесь устройство содержит газонепроницаемый шприц объемом 25 мкл, оснащенный держателем для микропипетки, и стоит в общей сложности менее 80 долларов США. Устройство легко собирается путем вставки держателя микропипетки в шприц с помощью фиксатора Luer (рисунок 1A). Затем устройство устанавливается непосредственно на микроманипулятор, что позволяет пользователю контролировать как его положение, так и всасывание одной рукой непосредственно на микроманипуляторе. Это удобно оставляет другую руку свободной для стабилизации и перемещения трансплантационной тарелки, содержащей донорские и принимающие эмбрионы. Устройство работает путем прямого всасывания воздухом и не нуждается в заполнении минеральным маслом. Из-за сил притяжения между водой и стенками стеклянной иглы большое движение в поршене шприца переводится в меньшее движение уровня воды внутри иглы, если уровень воды находится в коническом конце стеклянной иглы. Это позволяет точно контролировать количество аспирированных ячеек и место их вставки.
Чтобы продемонстрировать полезность этого устройства, мы представляем три приложения для эмбрионов рыбок данио (Danio rerio). Во-первых, мы покажем, как генерировать локализованные источники секретируемых сигнальных молекул, которые могут быть использованы для изучения образования градиента2,4,6. Здесь донорским эмбрионам вводят мРНК, кодирующую флуоресцентно меченую сигнальную молекулу. Затем флуоресцентные донорские клетки трансплантируются эмбрионам-хозяевам дикого типа, где образование градиента сигнала может быть визуализировано и проанализировано. Во-вторых, мы описываем, как устройство может быть использовано для удаления клеток путем экстирпации с целью получения эмбрионов уменьшенного размера5,13. Наконец, мы показываем, как надежно производить матерински-зиготные мутанты путем трансплантации клеток, несущих первичный репортер зародышевых клеток, в эмбрионы-хозяева, в которых зародышевая линия была удалена6,10. В дальнейшем описанное здесь устройство для трансплантации может быть легко адаптировано к другим эмбриологическим манипуляциям, требующим удаления или трансплантации клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mm glass capillary, ends cut without filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mL glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To coat plastic dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnd1 morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC 
			CAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To assess YSL injections and germ-line transplantations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Kimble Chase (via Fisher)</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator at 28 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer tip 25 &#956;L Hamilton syringe, 1700 series</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Ref: 80201</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator with 3 axes of movement</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For controlling the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual pipetting pump</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>Cat. # 641</td>
			<td>For use with the glass pipettes to transfer embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For moving and rotating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF2</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and morpholino into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds, triangular grooves</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare microinjection plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection-molds, single wells</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>To prepare transplantation plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH6S10</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 
			transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340M</td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid with GFP-nos1 3&#39;UTR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3&#39;UTR of nos1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dish 100 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td>For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection and transplantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos

Классические эмбриологические манипуляции, такие как удаление клеток и трансплантация клеток внутри или между эмбрионами, являются мощными методами изучения сложных процессов развития. Эмбрионы рыбок данио идеально подходят для этих манипуляций, так как они легко доступны, относительно велики по размеру и прозрачны. Однако ранее разработанные устройства для удаления и трансплантации клеток громоздки в использовании или дороги в покупке. Напротив, представленное здесь устройство для трансплантации экономично, просто в сборке и использовании. В этом протоколе мы сначала представляем обработку устройства для трансплантации, а также его сборку из коммерчески и широко доступных деталей. Затем мы представляем три приложения для его использования: генерация эктопических клонов для изучения рассеивания сигнала из локализованных источников, истребление клеток для производства эмбрионов с уменьшенным размером и трансплантация зародышевой линии для генерации материнских зиготных мутантов. Наконец, мы показываем, что инструмент также может быть использован для эмбриологических манипуляций у других видов, таких как японская рисовая рыба медака.

Успех и неудача в использовании устройства для трансплантации для трех применений, описанных выше, могут быть легко оценены путем визуального осмотра под стереомикроскопом. При успешных трансплантациях эмбрион должен выглядеть нормальным и похожим по форме и желточности на нетрансплантированные эмбрионы, без больших разрывов в бластодерме. Если эмбрион явно поврежден (рисунок 4B), он не будет развиваться нормально. В идеале трансплантированные клетки, экспрессирующие флуоресцентный маркер, должны выглядеть как непрерывная колонка при просмотре под флуоресцентным стереомикроскопом (рисунок 2А, рисунок 4А). Если столб фрагментирован, это указывает на то, что клетки были срезаны всасыванием в иглу для трансплантации или что осаждение клеток было сделано слишком энергично. Это можно предотвратить, перемещая поршень медленнее и мягко.
Хотя устройство для трансплантации в основном использовалось на эмбрионах рыбок данио на стадиях бластулы5,6, трансплантация и истребление клеток работают так же хорошо для дехорионированных эмбрионов бластулы японской рисовой рыбы медака (Oryzias latipes) (рисунок 2B). Помимо дехорионации эмбриона, которая была описана Porazinski, S. R. et al.17, можно следовать тем же процедурам, которые описаны выше.
В конкретном случае трансплантации зародышевой линии хорошая трансплантация приведет к появлению эмбриона с длинным горизонтальным столбом клеток непосредственно над краем желтка (рисунок 4А). Однако, были ли половые клетки успешно пересажены, можно оценить только на следующий день (рисунок 4C-F) из-за фоновой экспрессии GFP на стадиях бластулы (рисунок 1F). Первичные половые клетки будут выглядеть в виде небольших флуоресцентных сфер в канавке непосредственно над расширением желтка (рисунок 4C-E). Наличие этих клеток в правильном месте свидетельствует об успешной трансплантации зародышевой линии. Клетки с другой формой не являются половыми клетками (например, удлиненные клетки обычно являются мышечными клетками, рисунок 4F). Кроме того, если первичные половые клетки находятся за пределами бороздки, это означает, что они не смогли мигрировать должным образом, и они не смогут внести свой вклад в зародышевую линию эмбриона. Наконец, общая морфология трансплантированных эмбрионов должна быть похожа на нетрансплантированные эмбрионы (рисунок 4D); хвост не должен быть деформирован, а голова не должна быть сморщена или отсутствуют глаза (рисунок 4E). Эти дефекты, как правило, являются результатом чрезмерно высоких концентраций морфолино или повреждения эмбриона во время трансплантации. Эксперименты по трансплантации зародышевой линии, как описано здесь, обычно приводят к 1-2 из 6 эмбрионов-хозяев с успешно пересаженными половыми клетками для 60-80% донорских эмбрионов, в зависимости от опыта экспериментатора. Таким образом, клетки из 40-50 гомозиготных донорских эмбрионов должны быть пересажены в 200-300 эмбрионов-хозяев, чтобы вырастить примерно 30 особей с мутантными половыми клетками.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> Рисунок 1: Сборка и использование устройства для трансплантации. (A) Устройство для трансплантации собирается путем соединения газонепроницаемого шприца с держателем микропипетки через замок Luer. Стеклянная игла для трансплантации затем вводится в держатель микропипетки. (B) Фотография собранного устройства для трансплантации, установленного на микроманипуляторе (обратите внимание, что фон и этикетки были удалены с изображения). (C) При использовании устройства для трансплантации важно обеспечить, чтобы уровень воды в игле для трансплантации оставался на коническом конце. (D) Устройство используется под стереомикроскопом для извлечения и вставки клеток из и в эмбрионы телеоста, помещенные в отдельные колодцы трансплантационной чашки. (E) Для генерации эктопических источников клетки берутся с животного полюса донорского эмбриона (i-ii) и переносятся в полюс животного эмбриона хозяина (iii-vi). (F) Для трансплантации зародышевой линии большее количество клеток берется с края донорского эмбриона (i-ii), где расположены половые клетки. Затем клетки переносятся в край эмбрионов-хозяев (iii-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> Рисунок 2: Генерация клонов путем трансплантации клеток. (A) Пример двойного клона, генерируемого последовательной трансплантацией флуоресцентных клеток (зеленый) от донора рыбки данио в эмбрион хозяина рыбки данио. Одинарные и двойные клоны могут быть использованы для изучения того, как секретируемые сигнальные молекулы образуют пространственно-временные градиенты2,4,5,6. (B) Пример одного клона, полученного путем трансплантации клеток трансгенного донора медаки, экспрессирующего eGFP (Уимблдон)17, в хозяина медаки дикого типа. Шкалы представляют 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> Рисунок 3: Генерация эмбрионов уменьшенного размера путем экстирпации клеток. (A) Перед удалением клеток путем экстирпации YSL может быть помечен путем введения флуоресцентных красителей в две противоположные стороны YSL. (B) Пример эмбриона после инъекции YSL. (C) Для получения эмбрионов, уменьшенных по размеру, клетки с полюса животных удаляются путем экстирпации5. (D) Пример эмбриона после экстирпации клеток. Обратите внимание, что YSL остается нетронутым. Шкалы представляют 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> Рисунок 4: Трансплантация зародышевой линии. (А) Пример успешной трансплантации донорских клеток (зеленых) в маргинальную зону хозяина. (B) Пример неудачной трансплантации. Желток эмбриона-хозяина был сильно поврежден, и эмбрион не сможет нормально развиваться. (C) При 30 л.с.ф. успешно пересаженные половые клетки будут обнаружены исключительно в мезодерме гонад в передней области расширения желтка. (D) Пример успешной трансплантации, в которой несколько донорских половых клеток, меченных GFP, заполнили будущую гонаду хозяина. (E) Пример неудачной трансплантации. Хотя половые клетки достигли гонадной мезодермы, эмбрион хозяина сильно деформирован и не будет нормально развиваться. (F) Пример неудачной трансплантации. Флуоресцентные половые клетки, которые не смогли мигрировать в правильное место, не будут повторно заселять гонады. Шкала составляет 100 мкм. Изображения в D-F были сделаны с общим увеличением примерно в 50 раз. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Эмбриологические манипуляции, такие как экстирпация и трансплантация клеток, являются важными инструментами для изучения раннего развития. Этот протокол описывает простое и эффективное устройство трансплантации для выполнения этих манипуляций у эмбрионов рыбок данио.

Простое и эффективное устройство для трансплантации эмбрионов рыбок данио

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Методика позволяет изучать функцию и диапазон сигнальных молекул при эмбриогенезе путем трансплантации эктопических источников сигнализации. Это также способствует эффективной генерации мутантов зародышевой линии. Протокол может быть применен к эмбрионам данио и медаки стадии бластулы, а также, вероятно, к другим эмбриональным стадиям и видам TDO.Чтобы собрать устройство для трансплантации, подключите наконечник приманки 25 микролитров с газонепроницаемым шприцем к держателю микропипетки с помощью крепления замка приманки. Затем установите устройство непосредственно на ручной микроманипулятор. Чтобы использовать устройство для трансплантации, поместите микроманипулятор с собранным устройством рядом со стереомикроскопом.Затем извлеките поршень и вставьте иглу для трансплантации. Опустите иглу в тарелку, наполненную раствором Рингера под углом 45 градусов, пока кончик иглы не будет погружен. Вставьте плунжер примерно наполовину, чтобы промыть растворы Рингера, оставив только небольшой объем воды в тонкой конической части иглы.При использовании трансплантационной иглы в первый раз покройте внутреннюю часть иглы, вытянув ярмо из принесенного в жертву эмбриона и полностью изгнав материал хомута. Затем, используя иглу для трансплантации, аккуратно позиционируйте донорский эмбрион, затем позиционируйте открытие иглы ортогонально к поверхности эмбриона и осторожно потяните поршень, чтобы втянуть клетки в иглу. Как только нужное количество клеток будет втянуто, остановите всасывание, осторожно толкнув плунжер вниз и извлеките иглу из эмбриона, дергая иглу в сторону коротким и быстрым движением.Оставьте немного раствора Рингера по обе стороны клеточного столба, ограничив ячейки коническим концом иглы. Очистите оставшийся желток или клеточный мусор, медленно перемещая поршень вверх и вниз и промывая клетки раствором Рингера. Затем переместите тарелку для трансплантации недоминирующей рукой, чтобы расположить иглу ортогонально к поверхности эмбриона-хозяина.Приложите небольшое давление на эмбрион, осторожно прижав его к стенкам. Затем быстрым резким движением проткните обволакивающий слой эмбриона хозяина, следя за тем, чтобы не поцарапать желток иглой. Как только игла окажется внутри, осторожно протолкните поршень, чтобы выдавить столб клеток в эмбрион, и медленно втягивайте иглу одновременно.Для трансплантации половых клеток заполните тарелку для трансплантации раствором Рингера, затем перенесите дехорионированную сферу на купольную стадию эмбрионов в чашку для трансплантации и поместите эмбрионы хозяина и донора в чередующиеся столбцы для пересадки клеток от одного донорского эмбриона к шести различным эмбрионам хозяина. Для проведения трансплантации ориентируйте эмбрионы с запасом в сторону иглы для трансплантации. Для трансплантации зародышевой линии возьмите исходные клетки с края и поместите их в то же место в эмбрионе хозяина.Как только трансплантация будет завершена, позвольте эмбриону восстановиться в растворе Рингера в течение от 30 минут до одного часа. Затем с помощью флуоресцентного стереомикроскопа исследуют пересаженные клетки. Затем перенесите эмбрионы в 24-луночную пластину, покрытую агарозой, с эмбриональной средой, группирующей все эмбрионы-хозяева, которые получили клетки от одного и того же донора, в один и тот же колодец.Затем высиживают эмбрионы при 28 градусах Цельсия до следующего дня. При необходимости перенесите донорские эмбрионы в меченые полоски ПЦР для генотипирования. Через 30 часов после оплодотворения проведите скрининг эмбрионов-хозяев для успешной трансплантации зародышевой линии под флуоресцентным стереомикроскопом.Половые клетки должны присутствовать в канавке над расширением желтка. Вырастите успешно пересаженную личинку во взрослую жизнь в соответствии со стандартными условиями животноводства. При успешных трансплантациях эмбрион выглядит нормальным и похожим по форме и желточности на нетрансплантированные эмбрионы без больших разрывов в бластодерме.Напротив, если эмбрион заметно поврежден во время трансплантации, он не будет развиваться нормально. Хотя устройство для трансплантации в основном использовалось на эмбрионах рыбок данио на стадиях бластулы, трансплантация и экстирпация клеток также могут быть проведены в дехорионированных эмбрионах стадии бластулы японской рисовой рыбы медака. В конкретном случае трансплантации зародышевой линии хорошая трансплантация приводит к эмбриону с длинным горизонтальным столбом клеток непосредственно над краем желтка.Однако успех процедуры может быть оценен только после 24-30 часов оплодотворения, когда половые клетки отличаются по своей флуоресценции от соматических клеток. Первичные половые клетки будут появляться в виде небольших флуоресцентных сфер в канавке непосредственно над расширением желтка. Наличие этих половых клеток в правильном месте указывает на успешную трансплантацию зародышевой линии.Примеры неудачных трансплантаций приведены здесь. В первом примере, хотя половые клетки достигли мезодермы гонады, поскольку эмбрион хозяина сильно деформирован, он не будет развиваться нормально. Во втором примере флуоресцентные клетки обнаруживаются только вне канавки.Эти клетки являются либо соматическими клетками, либо половыми клетками, которые не смогли правильно мигрировать. И оба типа клеток не будут способствовать зародышевой линии эмбриона. Очень важно избегать повреждения трансплантированных клеток и эмбриона хозяина.Клетки должны быть составлены медленно, очищены от оставшегося желтка и аккуратно вставлены. Этот метод обеспечивает простой способ трансплантации клеток эмбрионов рыбок данио и будет полезен для генерации эктопических источников и мутантов зародышевой линии. Главное преимущество этого устройства, это невысокая стоимость, а также много и используется.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Аффинное мечение Обнаружение эндогенного Рецепторы из эмбрионов данио рерио

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Плоидность Манипуляция эмбрионов данио рерио с теплового шока 2 Лечение

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Модифицированный MicroSecure Витрификация: Безопасный, простой и очень эффективная процедура криоконсервации для человека бластоцисты

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...