Name: a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00
Duration: 6 min 59 s
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Este proyecto fue apoyado por la Sociedad Max Planck y recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 637840 (QUANTPATTERN) y acuerdo de subvención n.º 863952 (ACE-OF-SPACE)).

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El éxito de un experimento de trasplante depende en gran medida de las habilidades motoras finas del experimentador. Para llevar a cabo con éxito los procedimientos, se requiere práctica. Sin embargo, el instrumento presentado aquí es relativamente fácil de aprender y usar en comparación con otros en el mercado y, en general, solo se necesitan unos pocos días de práctica.
El éxito del procedimiento de trasplante se puede mejorar tomando varias precauciones. Un paso es asegurarse de que el micromanipulador sea de buena calidad y capaz de funcionar sin problemas. Agregar un ocular con mayor aumento al estereomicroscopio puede ayudar a posicionar con precisión la aguja en relación con el embrión. El uso de peces cebra o medaka bien reproductores para adquirir embriones sanos y tener cuidado de no dañar los embriones durante el manejo (especialmente durante y después de la etapa de deselección) también mejorará la tasa de éxito.
Los problemas con la toxicidad retardada pueden ser más difíciles de solucionar. Si un embrión muere después de unas horas, pero no inmediatamente después del trasplante, la yema podría haber sido dañada por la aguja (por ejemplo, al ingresar al embrión demasiado profundamente), o tal vez las células fueron expulsadas con demasiada fuerza. La toxicidad retardada y la muerte embrionaria también pueden ser el resultado de la yema o los restos celulares inyectados junto con las células del donante; otra causa puede ser el deterioro del búfer HEPES en la solución de Ringer. Estos problemas se pueden superar lavando las células (ver paso 1.3.8) o simplemente usando un nuevo lote de tampón, respectivamente. Además, los embriones huésped deformados en experimentos de trasplante de línea germinal podrían ser el resultado de concentraciones excesivamente altas de morfolino. Es crucial usar suficiente morfolino para extirpar completamente la línea germinal de tipo salvaje del huésped, evitando así que estas células contribuyan a la descendencia, pero al mismo tiempo, se deben evitar las concentraciones excesivamente altas de morfolino. Por lo tanto, las cantidades consistentes de morfolino en todos los embriones huésped inyectados (unos pocos cientos en un experimento típico) son clave para el éxito de los trasplantes de línea germinal. Esto se puede ayudar complementando la mezcla de inyección de morfolino con un tinte trazador fácilmente visible14, que se puede rastrear bajo un estereomicroscopio de fluorescencia para garantizar que todos los embriones reciban el mismo volumen de inyección.
Los procedimientos descritos en este protocolo implican exclusivamente manipulaciones de células en embriones de pez cebra en etapa de blástula o medaka, pero en el futuro, es probable que sea posible adaptar el dispositivo a diferentes etapas y especies cambiando el diámetro y la forma de la aguja de trasplante.

A partir de los experimentos clásicos de Mangold y Spemann que demostraron la existencia de un organizador que instruye la formación de un eje embrionario1, el trasplante de células entre embriones se ha convertido en una técnica establecida para estudiar el desarrollo embrionario2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Una configuración comúnmente utilizada para el trasplante consiste en una jeringa hermética al gas controlada por accionamiento micrométrico conectada a un soporte de micropipeta a través de tubos flexibles y un depósito lleno de aceite mineral12,13. En esta configuración, el émbolo de la jeringa se mueve a través de un tornillo. La presión generada de esta manera se transfiere a la micropipeta y se utiliza para extraer células de un embrión y depositarlas en otro. Sin embargo, este dispositivo operado hidráulicamente consta de muchas piezas y es laborioso de ensamblar desde cero. Dispositivos similares también se pueden comprar como un conjunto de trabajo completo, generalmente se venden como microinyectores manuales, y estas versiones comerciales generalmente cuestan más de 1500 US $. Tanto en la versión casera como en la comercial, la micropipeta para la manipulación embrionaria se separa del dispositivo generador de presión (la jeringa hermética al gas) a través de tubos llenos de aceite. La manipulación de la micropipeta y el movimiento del émbolo, por lo tanto, deben operarse por separado con diferentes manos, lo que reduce el rendimiento y la utilidad. Además, los dispositivos son engorrosos para prepararse para el trasplante, ya que el tubo debe llenarse cuidadosamente con aceite y evitar la formación de burbujas. Aquí, describimos un dispositivo alternativo operado neumáticamente para la extracción y el trasplante de células que es económico, fácil de ensamblar y fácil de usar.
El dispositivo que se presenta aquí comprende una jeringa hermética al gas de 25 μL equipada con un soporte de micropipeta y cuesta menos de 80 us$ en total. El dispositivo se monta fácilmente insertando el soporte de micropipeta en la jeringa a través del accesorio de bloqueo Luer (Figura 1A). El dispositivo se monta directamente en un micromanipulador, lo que permite al usuario controlar tanto su posición como la succión con una sola mano directamente en el micromanipulador. Esto deja convenientemente la otra mano libre para estabilizar y mover el plato de trasplante que contiene embriones de donantes y huéspedes. El dispositivo funciona por succión directa con aire y no necesita llenarse con aceite mineral. Debido a las fuerzas de atracción entre el agua y las paredes de la aguja de vidrio, un gran movimiento en el émbolo de la jeringa se traduce en un movimiento más pequeño en el nivel del agua dentro de la aguja, siempre que el nivel del agua esté en el extremo cónico de la aguja de vidrio. Esto permite un control preciso sobre el número de células aspiradas y la ubicación de su inserción.
Para demostrar la utilidad de este dispositivo, presentamos tres aplicaciones en embriones de pez cebra (Danio rerio). En primer lugar, mostramos cómo generar fuentes localizadas de moléculas de señalización secretadas, que pueden utilizarse para estudiar la formación de gradientes2,4,6. Aquí, los embriones de donantes se inyectan con ARNm que codifica una molécula de señalización marcada fluorescentemente. Las células donantes marcadas con fluorescencia se trasplantan a embriones huésped de tipo salvaje donde se puede obtener imágenes y analizar la formación de un gradiente de señal. En segundo lugar, describimos cómo se puede utilizar el dispositivo para extraer células mediante extirpación con el fin de generar embriones de tamaño reducido5,13. Finalmente, mostramos cómo producir de forma robusta mutantes materno-cigóticos mediante el trasplante de células portadoras de un reportero de células germinales primordiales en embriones huésped en los que la línea germinal había sido ablacionada6,10. En el futuro, el dispositivo de trasplante descrito aquí se puede adaptar fácilmente a otras manipulaciones embriológicas que requieren la extracción o el trasplante de células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mm glass capillary, ends cut without filament</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mL glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to incubate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To coat plastic dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnd1 morpholino</td>
			<td>Gene Tools</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC 
			CAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To assess YSL injections and germ-line transplantations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Kimble Chase (via Fisher)</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator at 28 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For incubating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer tip 25 &#956;L Hamilton syringe, 1700 series</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Ref: 80201</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator with 3 axes of movement</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>For controlling the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual pipetting pump</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>Cat. # 641</td>
			<td>For use with the glass pipettes to transfer embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For moving and rotating zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF2</td>
			<td>To make the transplantation needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and morpholino into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection molds, triangular grooves</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To prepare microinjection plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection-molds, single wells</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>To prepare transplantation plates with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MPH6S10</td>
			<td>Part of the transplantation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 
			transcription kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1340M</td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid with GFP-nos1 3&#39;UTR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3&#39;UTR of nos1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dish 100 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td>For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection and transplantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective transplantation device for zebrafish embryos

Las manipulaciones embriológicas clásicas, como la extracción de células y el trasplante de células dentro o entre embriones, son técnicas poderosas para estudiar procesos de desarrollo complejos. Los embriones de pez cebra son ideales para estas manipulaciones, ya que son de fácil acceso, de tamaño relativamente grande y transparentes. Sin embargo, los dispositivos desarrollados previamente para la extracción y el trasplante de células son engorrosos de usar o costosos de comprar. En contraste, el dispositivo de trasplante presentado aquí es económico, fácil de ensamblar y fácil de usar. En este protocolo, primero introducimos el manejo del dispositivo de trasplante, así como su ensamblaje a partir de piezas comercialmente y ampliamente disponibles. A continuación, presentamos tres aplicaciones para su uso: generación de clones ectópicos para estudiar la dispersión de señales de fuentes localizadas, extirpación de células para producir embriones de tamaño reducido y trasplante de línea germinal para generar mutantes materno-cigóticos. Finalmente, mostramos que la herramienta también se puede utilizar para manipulaciones embriológicas en otras especies como el pez arroz japonés medaka.

El éxito y el fracaso en el uso del dispositivo de trasplante para las tres aplicaciones descritas anteriormente se pueden evaluar fácilmente mediante inspección visual bajo un estereomicroscopio. En los trasplantes exitosos, el embrión debe verse normal y similar en forma y claridad de yema a los embriones no trasplantados, sin grandes desgarros en el blastodermo. Si el embrión está visiblemente dañado (Figura 4B), no se desarrollará normalmente. Idealmente, las células trasplantadas que expresan un marcador fluorescente deben aparecer como una columna continua cuando se ven bajo un estereomicroscopio de fluorescencia (Figura 2A, Figura 4A). Si la columna está fragmentada, esto indica que las células fueron cortadas por la succión en la aguja de trasplante o que la deposición de las células se realizó con demasiada fuerza. Esto se puede prevenir moviendo el émbolo más lenta y suavemente.
Aunque el dispositivo de trasplante se ha utilizado principalmente en embriones de pez cebra en etapas de blástula5,6, el trasplante y la extirpación celular funcionan igual de bien para embriones descimoronados en etapa de blástula del pez arroz japonés medaka (Oryzias latipes) (Figura 2B). Aparte de la deselección embrionaria, descrita por Porazinski, S. R. et al.17, se pueden seguir los mismos procedimientos descritos anteriormente.
En el caso específico del trasplante de línea germinal, un buen trasplante dará como resultado un embrión con una larga columna horizontal de células directamente por encima del margen de la yema (Figura 4A). Sin embargo, si las células germinales se trasplantaron con éxito solo se puede evaluar al día siguiente (Figura 4C-F) debido a la expresión de fondo de GFP en las etapas de la blástula (Figura 1F). Las células germinales primordiales aparecerán como pequeñas esferas fluorescentes en el surco directamente sobre la extensión de la yema (Figura 4C-E). La presencia de estas células en la ubicación correcta indica un trasplante exitoso de la línea germinal. Las células con una forma diferente no son células germinales (por ejemplo, las células alargadas son típicamente células musculares, Figura 4F). Además, si las células germinales primordiales se encuentran fuera del surco, esto significa que no han podido migrar correctamente y no podrán contribuir a la línea germinal del embrión. Finalmente, la morfología general de los embriones trasplantados debe parecer similar a la de los embriones no trasplantados (Figura 4D); la cola no debe deformarse, y la cabeza no debe encogerse o faltar ojos (Figura 4E). Estos defectos generalmente son el resultado de concentraciones excesivamente altas de morfolino o del daño embrionario durante el trasplante. Los experimentos de trasplante de línea germinal como se describe aquí generalmente darán como resultado 1-2 de cada 6 embriones huésped con células germinales trasplantadas con éxito para el 60% -80% de los embriones de donantes, dependiendo de la experiencia del experimentador. Por lo tanto, las células de 40-50 embriones de donantes homocigotos deben trasplantarse a 200-300 embriones huésped para criar aproximadamente 30 individuos con células germinales mutantes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> Figura 1: Montaje y uso del dispositivo de trasplante. (A) El dispositivo de trasplante se ensambla conectando una jeringa hermética al gas con un soporte de micropipeta a través del accesorio de bloqueo Luer. La aguja de vidrio para el trasplante se inserta en el soporte de la micropipeta. (B) Fotografía del dispositivo de trasplante ensamblado montado en un micromanipulador (tenga en cuenta que el fondo y las etiquetas se han eliminado de la imagen). (C) Al utilizar el dispositivo de trasplante, es importante asegurarse de que el nivel de agua en la aguja de trasplante permanezca en el extremo cónico. (D) El dispositivo se utiliza bajo un estereomicroscopio para extraer e insertar células de y dentro de embriones teleósteos colocados en pocillos individuales de un plato de trasplante. (E) Para la generación de fuentes ectópicas, las células se toman del polo animal de un embrión donante (i-ii) y se transfieren al polo animal de un embrión huésped (iii-vi). (F) Para el trasplante de línea germinal, se toma un mayor número de células del margen de un embrión donante (i-ii), donde se encuentran las células germinales. Las células se transfieren al margen de los embriones huésped (iii-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> Figura 2: Generación de clones por trasplante celular. (A) Ejemplo de un clon doble generado por trasplante secuencial de células fluorescentes (verde) de un donante de pez cebra a un embrión huésped de pez cebra. Los clones simples y dobles se pueden utilizar para estudiar cómo las moléculas de señalización secretadas forman gradientes espaciotemporales2,4,5,6. (B) Ejemplo de un solo clon generado por el trasplante de células de un donante de medaka transgénico que expresa eGFP (Wimbledon)17 a un huésped medaka de tipo salvaje. Las barras de escala representan 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> Figura 3: Generación de embriones de tamaño reducido mediante extirpación celular. (A) Antes de eliminar células por extirpación, el YSL se puede etiquetar inyectando colorantes fluorescentes en dos lados opuestos del YSL. (B) Ejemplo de un embrión después de la inyección de YSL. (C) Para generar embriones de tamaño reducido, las células del polo animal se eliminan mediante extirpación5. (D) Ejemplo de un embrión después de la extirpación celular. Tenga en cuenta que el YSL permanece intacto. Las barras de escala representan 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> Figura 4: Trasplante de línea germinal. (A) Ejemplo de un trasplante exitoso de células de donantes (verde) en la zona marginal del huésped. (B) Ejemplo de un trasplante fallido. La yema del embrión huésped fue severamente dañada, y el embrión no podrá desarrollarse normalmente. (C) A 30 hpf, las células germinales trasplantadas con éxito se encontrarán únicamente en el mesodermo gonadal en la región anterior de la extensión de la yema. (D) Ejemplo de un trasplante exitoso en el que varias células germinales de donantes marcadas con GFP han poblado la futura gónada del huésped. (E) Ejemplo de un trasplante fallido. Aunque las células germinales han alcanzado el mesodermo gonadal, el embrión huésped está severamente deformado y no se desarrollará normalmente. (F) Ejemplo de un trasplante fallido. Las células germinales fluorescentes que no migraron a la ubicación correcta no repoblarán las gónadas. Las barras de escala representan 100 μm. Las imágenes en D-F se tomaron con un aumento total de aproximadamente 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Las manipulaciones embriológicas como la extirpación y el trasplante de células son herramientas importantes para estudiar el desarrollo temprano. Este protocolo describe un dispositivo de trasplante simple y efectivo para realizar estas manipulaciones en embriones de pez cebra.

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

La técnica permite estudiar la función y el rango de las moléculas de señalización durante la embriogénesis mediante el trasplante de fuentes de señalización ectópica. También facilita la generación eficiente de mutantes de la línea germinal. El protocolo se puede aplicar a embriones de pez cebra y medaka en etapa de blástula, y probablemente también a otras etapas embrionarias y especies de TDO.Para montar el dispositivo de trasplante, conecte una jeringa hermética de gas de 25 microlitros con punta de señuelo a un soporte de micro pipeta utilizando el accesorio de bloqueo de señuelo. A continuación, monte el dispositivo directamente en un micromanipulador manual. Para usar el dispositivo de trasplante, coloque el micromanipulador con el dispositivo ensamblado junto a un microscopio estéreo.Luego retire el émbolo e inserte la aguja de trasplante. Baje la aguja en un plato lleno de solución de Ringer en un ángulo de 45 grados hasta que la punta de la aguja se sumerja. Inserte el émbolo aproximadamente hasta la mitad para eliminar las soluciones de Ringer, dejando solo un pequeño volumen de agua en la parte delgada y cónica de la aguja.Cuando use una aguja de trasplante por primera vez, cubra el interior de la aguja extrayendo el yugo de un embrión sacrificado y expulsando el material del yugo por completo. A continuación, con una aguja de trasplante, coloque suavemente el embrión donante, luego coloque la abertura ortogonal de la aguja en la superficie del embrión y tire cuidadosamente del émbolo para atraer las células a la aguja. Una vez que se extrae el número deseado de células, detenga la succión empujando suavemente el émbolo hacia abajo y retire la aguja del embrión sacudiendo la aguja hacia un lado en un movimiento corto y rápido.Deje un poco de solución de Ringer a cada lado de la columna celular restringiendo las celdas al extremo cónico de la aguja. Limpie cualquier resto de yema o residuos celulares moviendo lentamente el émbolo hacia arriba y hacia abajo y lavando las células con la solución de Ringer. A continuación, mueva la placa de trasplante con la mano no dominante para colocar la aguja ortogonal en la superficie del embrión huésped.Aplique una ligera presión sobre el embrión apretándolo cuidadosamente contra las paredes. Luego, con un movimiento rápido y agudo, perfore la capa envolvente del embrión huésped teniendo cuidado de no rascar la yema con la aguja. Una vez que la aguja esté dentro, empuje suavemente el émbolo para extruir la columna de células en el embrión y retraiga lentamente la aguja simultáneamente.Para el trasplante de células germinales, llene un plato de trasplante con la solución de Ringer, luego transfiera la esfera decorionada a los embriones de etapa de cúpula en el plato de trasplante y coloque los embriones del huésped y el donante en columnas alternas para trasplantar las células de un embrión donante a seis embriones huésped diferentes. Para llevar a cabo el trasplante, oriente los embriones con el margen hacia la aguja de trasplante. Para el trasplante de línea germinal, tome las células de origen del margen y depositelas en la misma ubicación en el embrión huésped.Una vez que se complete el trasplante, permita que el embrión se recupere en la solución de Ringer durante 30 minutos a una hora. Luego, usando un microscopio estereoscópico de fluorescencia, examine las células trasplantadas. A continuación, transfiera los embriones a una placa recubierta de agarosa de 24 pocillos con medio embrionario que agrupa todos los embriones huésped que recibieron células del mismo donante en el mismo pozo.Luego incubar los embriones a 28 grados centígrados hasta el día siguiente. Si es necesario, transfiera los embriones de la donante a tiras de PCR marcadas para el genotipado. 30 horas después de la fertilización, examine los embriones huéspedes para trasplantes exitosos de la línea germinal bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.Las células germinales deben estar presentes en el surco por encima de la extensión de la yema. Cultive la larva trasplantada con éxito a la capucha adulta de acuerdo con las condiciones de cría estándar. En los trasplantes exitosos, el embrión se ve normal y similar en forma y claridad de yema a los embriones no trasplantados sin grandes desgarros en el blastodermo.Por el contrario, si un embrión se daña visiblemente durante el trasplante, no se desarrollará normalmente. Aunque el dispositivo de trasplante se ha utilizado principalmente en embriones de pez cebra en etapas de blástula, el trasplante y la extirpación celular también se pueden llevar a cabo en embriones de etapa de blástula descoronada del pez arroz japonés medaka. En el caso específico del trasplante de línea germinal, un buen trasplante da como resultado un embrión con una larga columna horizontal de células directamente por encima del margen de la yema.Sin embargo, el éxito del procedimiento solo se puede evaluar después de 24 a 30 horas de fertilización cuando las células germinales son distintas en su fluorescencia de las células somáticas. Las células germinales primordiales aparecerán como pequeñas esferas fluorescentes en el surco directamente sobre la extensión de la yema. La presencia de estas células germinales en la ubicación correcta indica un trasplante exitoso de la línea germinal.Aquí se muestran ejemplos de trasplantes fallidos. En el primer ejemplo, aunque las células germinales han alcanzado el mesodermo gonadal, como el embrión huésped está severamente deformado, no se desarrollará normalmente. En el segundo ejemplo, las células fluorescentes solo se detectan fuera de la ranura.Estas células son células somáticas o células germinales que no pudieron migrar correctamente. Y ambos tipos de células no contribuirán a la línea germinal del embrión. Es fundamental evitar el daño a las células trasplantadas y al embrión huésped.Las células deben extraerse lentamente, limpiarse de cualquier yema restante e insertarse con cuidado. Este método proporciona una manera fácil de trasplantar células en embriones de pez cebra, y será útil para generar fuentes ectópicas y mutantes de la línea germinal. La principal ventaja de este dispositivo, es de bajo costo, y es mucho y utiliza.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...