Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتور هيرفي ريميجي من Thermo Fisher Scientific على المشورة المفيدة. تم إجراء تجارب cryo-EM في منشأة Academia Sinica Cryo-EM (ASCEM). يتم دعم ASCEM من قبل Academia Sinica (رقم المنحة. AS-CFII-108-110) ومشروع تايوان للبروتين (رقم المنحة. AS-KPQ-109-TPP2). كما يشكر المؤلفون السيدة هوي - جو هوانغ على المساعدة التي قدمتها في إعداد العينة.

ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام جهاز تزجيج تجاري معدل لإعداد عينات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) في درجات حرارة محددة، وخاصة أعلى من 37 درجة مئوية. يظهر الإعداد التجريبي العام في الشكل 1. يستخدم البروتوكول 55 درجة مئوية كمثال. للاطلاع على الظروف المحددة في درجات الح...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

في الخطوة 1 من البروتوكول ، تأكد من تثبيت أنبوب جهاز الطرد المركزي بشكل جيد ولا يسقط عندما تكون التجربة قيد التقدم. نظرا لتراكم عدد كبير من قطرات الماء في الغرفة ، مما قد يغير قدرة الامتزاز لورق الترشيح ، يوصى بعدم تجاوز الوقت الإجمالي للتجربة 30 دقيقة بعد وصول غرفة جهاز التزجيج إلى درجة حرا?...

استمرت تقنية cryo-EM لحل هياكل مجمعات البروتين في التحسن ، خاصة في اتجاه الحصول على هياكل عالية الدقة 1,2. في غضون ذلك ، تم توسيع نطاق تطبيقه أيضا عن طريق تغيير ظروف العينة مثل الرقم الهيدروجيني أو الليكاندات قبل عملية التزجيج3 ، والتي تنطوي على إعداد شبكات العينات تليها تجميد الغطس 4,5. شرط آخر مهم هو درجة الحرارة. على الرغم من أن تجارب cryo-EM ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، يتم إجراؤها في درجات حرارة منخفضة ، إلا أن البنية التي تم حلها بواسطة cryo-EM تعكس البنية في حالة الحل قبل التزجيج. حتى وقت قريب، تستخدم غالبية دراسات تحليل الجسيمات المفردة (SPA) cryo-EM عينات يتم الاحتفاظ بها على الجليد (أي عند 4 درجات مئوية) قبل التزجيج6، على الرغم من أن عددا من الدراسات تستخدم عينات عند درجة حرارة الغرفة حوالي7،8،9،10 أو تصل إلى 42 درجة مئوية 11. في تقرير حديث ، أجرينا دراسات تعتمد على درجة الحرارة لإنزيم اختزال حمض الكيتول (KARI) من الأركايون المحب للحرارة Sulfolobus solfataricus (Sso) في ست درجات حرارة مختلفة من 4 درجات مئوية إلى 70 درجة مئوية12. تشير دراساتنا إلى أنه من المهم إعداد شبكات العينات في درجات حرارة ذات صلة وظيفيا وأن cryo-EM هي الطريقة الهيكلية الوحيدة الممكنة عمليا لحل بنية نفس مركب البروتين في درجات حرارة متعددة.
تتمثل الصعوبة الرئيسية للتزجيج في درجات الحرارة العالية في تقليل تكثيف البخار وتحقيق جليد رقيق. هنا نبلغ عن البروتوكول التفصيلي المستخدم لإعداد شبكات العينات في درجات حرارة عالية في دراستنا السابقة ل Sso-KARI 12. نفترض أن القراء أو المشاهدين لديهم خبرة بالفعل في إجراءات إعداد العينات ومعالجة البيانات الشاملة لتجارب cryo-EM ونؤكد على الجوانب ذات الصلة بارتفاع درجة الحرارة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

عادة ما يتم إعداد شبكات العينات لتجارب المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) عند درجة حرارة مثالية لتخزين العينات البيولوجية ، معظمها عند 4 درجات مئوية وأحيانا في درجة حرارة الغرفة. في الآونة الأخيرة ، اكتشفنا أن بنية البروتين التي تم حلها في درجة حرارة منخفضة قد لا تكون ذات صلة وظيفية ، خاصة بالنسبة للبروتينات من العتائق المحبة للحرارة. تم تطوير إجراء لإعداد عينات البروتين في درجات حرارة أعلى (تصل إلى 70 درجة مئوية) لتحليل cryo-EM. أظهرنا أن الهياكل من العينات المعدة في درجات حرارة أعلى ذات صلة وظيفية وتعتمد على درجة الحرارة. هنا نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجة حرارة عالية ، باستخدام 55 درجة مئوية كمثال. استخدمت التجربة جهاز تزجيج تم تعديله باستخدام أنبوب طرد مركزي إضافي ، وتم تحضين العينات عند 55 درجة مئوية. تم ضبط الإجراءات التفصيلية بدقة لتقليل تكثيف البخار والحصول على طبقة رقيقة من الجليد على الشبكة. يتم تقديم أمثلة على التجارب الناجحة وغير الناجحة.

يتم عرض نظرة عامة على التكبير المنخفض في الشكل 5A و B. اللوحة A هي مثال على شبكة ناجحة. هناك تدرج جليدي من أعلى اليسار (أكثر سمكا) إلى أسفل اليمين (أرق أو فارغ). تسهل هذه الشبكة العثور على سمك مناسب لطبقة الجليد في المنطقة الوسطى مناسب لجمع البيانات ، مثل المربعات الزرق?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجات حرارة تصل إلى 70 درجة مئوية، قبل التجمد الغاطس لتجارب التبريد الكهرومغناطيسي.

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

تعتمد وظائف البروتينات على درجة الحرارة وهي مثالية عند درجة الحرارة. يوفر هذا البروتوكول طريقة لحل هياكل البروتين في درجات حرارة أعلى. يمكن أن يوفر هذا النهج هياكل ذات صلة وظيفيا ويعزز فهم الاعتماد على درجة حرارة هياكل البروتين.وسيوضح الإجراء يوان تشيه تشانغ ، مدير منشأة أكاديمية سينيكا كريو EM. ابدأ بعمل ثقب سنتيمتر واحد في أنبوب طرد مركزي 50 ملم في نهايته المغلقة. ضع الأنبوب في غرفة جهاز التزجيج عند مخرج المياه بالموجات فوق الصوتية.قم بإعداد درجة حرارة جهاز التزجيج إلى درجة الحرارة المحددة ، واسمح لغرفة جهاز التزجيج بالوصول إلى 55 درجة مئوية ورطوبة نسبية 100٪. دعها تقف لمدة نصف ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في الظروف قبل بدء التجربة. ضع الحمام المائي على صفيحة ساخنة واضبط الصفيحة الساخنة على درجة الحرارة المطلوبة.تحقق من ذلك باستخدام ميزان حرارة للتأكد من أن الماء يصل إلى 55 درجة مئوية. احتضن العينة في الحمام المائي ، وقم بتسخين طرف الماصة على حافة الصفيحة الساخنة لمدة دقيقتين أو أكثر قبل تجربة النشاف. تفريغ التوهج شبكة مدعومة بالكربون في هولي عند 25 مللي أمبير لمدة 30 ثانية.ضع ورقة ترشيح التزجيج في غرفة جهاز التزجيج في موعد لا يتجاوز خمس دقائق قبل تجربة النشاف. احتضان الملقط مع الشبكة في جهاز التزجيج لمدة دقيقتين أو أكثر. قم ببناء حاوية الإيثان مع الإيثان وفقا للإجراءات القياسية ، مما يضمن عدم فيضان الإيثان.استخدم ماصة لتطبيق سبعة إلى تسعة ميكرولترات من العينة على الشبكة. ثم انتظر لمدة ثانية إلى ثانيتين ، ولطخت لمدة ثانية إلى ثانية ونصف ، وسرعان ما تغرق العينة في الإيثان السائل. انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى صندوق التبريد المخزن في النيتروجين السائل.قم بقص الشبكات وتفريغها للحصول على المجهر الإلكتروني أو أداة Cryo EM. استخدم شاشة العرض الخاصة بجهاز Cryo EM ووظيفة الجرعة المنخفضة للبرنامج ، لفحص حالة الجليد على الشبكة وتوزيع العينة على الشبكة. إذا لم تكن جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر عملية إعداد الشبكة بظروف متنوعة مثل وقت الانتظار ووقت النشاف وما إلى ذلك.إذا كانت جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر نفس الخطوات لإنشاء شبكات عند درجة حرارة مختلفة. انقل الشبكات ذات النوعية الجيدة إلى أداة Cryo EM عالية الدقة. إجراء جمع البيانات وتحليلها وفقا للإجراءات المعمول بها.في حالة الشبكة الناجحة ، يتكون تدرج الجليد من جليد أكثر سمكا في أعلى يسار الشبكة وجليد أرق في أسفل اليمين. ولوحظت مربعات زرقاء وخضراء مناسبة لجمع البيانات في الشبكة الناجحة. لوحظ تباين مشرق في الشبكة الأخرى.تشير إلى طبقة رقيقة من الجليد أو غياب الجليد. تم العثور على مربعين فقط مناسبين لجمع البيانات في الشبكة الثانية. تألفت إحدى الشبكات من الجليد في الغالب في شكل بلورات ، والتي كانت غير مناسبة لجمع البيانات.من ناحية أخرى ، أظهرت الشبكة الأخرى أن الطبقة الجليدية كانت في الغالب في حالة غير متبلورة مناسبة لجمع البيانات. يجب أن يكتمل إعداد الحاوية وغيرها وفقا لنقطة زمنية. التحكم في الوقت وإنهاء التجربة بسرعة ودقة هي الأكثر أهمية.اعتمادا على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول ، قد يتعين على الباحث أن يكون أكثر حذرا في إعداد الشروط البسيطة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...