Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Hervé Remigy fra Thermo Fisher Scientific for nyttige råd. Kryo-EM-eksperimenterne blev udført på Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM er støttet af Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) og Taiwan Protein Project (tilskudsnr. AS-KPQ-109-TPP2). Forfatterne takker også fru Hui-Ju Huang for hjælpen med prøveforberedelsen.

BEMÆRK: Denne protokol sigter mod at anvende et modificeret kommercielt vitrifikationsapparat til at forberede kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prøver ved specifikke temperaturer, især højere end 37 ° C. Den samlede forsøgsopstilling er vist i figur 1. Protokollen bruger 55 °C som eksempel. For de særlige forhold ved andre temperaturer henvises til supplerende tabel 2 i reference12.
1. Fremstilling af forglasningsapparatet
<ol><...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

I trin 1 i protokollen skal du sørge for, at centrifugerøret er installeret godt og ikke falder, når eksperimentet er i gang. På grund af akkumuleringen af et stort antal vanddråber i kammeret, som kan ændre filterpapirets adsorptionskapacitet, anbefales det, at eksperimentets samlede tid ikke overstiger 30 minutter efter, at vitrifikationsapparatets kammer nåede ligevægtstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, skal operatøren udskifte filterpapiret og vente på, at kabinen balancerer temperatur o...

Kryo-EM-teknologien til løsning af strukturerne i proteinkomplekser er fortsat med at blive forbedret, især i retning af at opnå strukturer med høj opløsning 1,2. I mellemtiden er landskabet for dets anvendelse også blevet udvidet ved at variere prøvebetingelserne såsom pH eller ligander forud for forglasningsprocessen3, hvilket indebærer forberedelse af prøvegitter efterfulgt af springfrysning 4,5. En anden vigtig betingelse er temperaturen. Selvom cryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, udføres ved lave temperaturer, afspejler strukturen løst af cryo-EM strukturen ved opløsningstilstanden før vitrifikation. Indtil for nylig bruger størstedelen af enkeltpartikelanalyse (SPA) cryo-EM-undersøgelser prøver, der opbevares på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifikation6, selvom en række undersøgelser bruger prøver ved omkring stuetemperatur 7,8,9,10 eller så højt som 42 ° C 11. I en nylig rapport udførte vi temperaturafhængige undersøgelser af enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile arkæon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskellige temperaturer fra 4 °C til 70 °C12. Vores undersøgelser tyder på, at det er vigtigt at forberede prøvegitter ved funktionelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metode, der er praktisk mulig til at løse strukturen af det samme proteinkompleks ved flere temperaturer.
Den største vanskelighed ved forglasning ved høje temperaturer er at minimere dampkondensation og opnå tynd is. Her rapporterer vi den detaljerede protokol, der blev brugt til fremstilling af prøvegitter ved høje temperaturer i vores tidligere undersøgelse af Sso-KARI 12. Vi antager, at læserne eller seerne allerede har erfaring med den samlede prøveforberedelse og databehandlingsprocedurer for cryo-EM-eksperimenter og understreger de aspekter, der er relevante for høj temperatur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

Prøvegitterene til kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles normalt ved en temperatur, der er optimal til opbevaring af biologiske prøver, for det meste ved 4 °C og lejlighedsvis ved stuetemperatur. For nylig opdagede vi, at proteinstrukturen løst ved lav temperatur muligvis ikke er funktionelt relevant, især for proteiner fra termofile arkæer. Der blev udviklet en procedure til fremstilling af proteinprøver ved højere temperaturer (op til 70 °C) til cryo-EM-analyse. Vi viste, at strukturerne fra prøver fremstillet ved højere temperaturer er funktionelt relevante og temperaturafhængige. Her beskriver vi en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitre ved høj temperatur ved hjælp af 55 °C som eksempel. Forsøget gjorde brug af et forglasningsapparat modificeret ved hjælp af et yderligere centrifugerør, og prøverne blev inkuberet ved 55 °C. De detaljerede procedurer blev finjusteret for at minimere dampkondensation og opnå et tyndt lag is på gitteret. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter gives.

Oversigten over lav forstørrelse er vist i figur 5A,B. Panel A er et eksempel på et vellykket gitter. Der er en isgradient fra øverst til venstre (tykkere) til nederst til højre (tyndere eller tom). Et sådant gitter gør det lettere at finde en passende tykkelse af islaget i det midterste område, der er egnet til dataindsamling, såsom de blå og grønne kasser. Gitteret B er for tørt. Firkanterne i gitteret har lys kontrast, hvilket betyder, at islaget er for tyndt, ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Dette papir giver en detaljeret protokol til forberedelse af prøvegitter ved temperaturer så høje som 70 ° C, inden nedfrysning til cryo-EM-eksperimenter.

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Proteinernes funktioner er temperaturafhængige og er optimale ved temperaturen. Denne protokol giver en måde at løse proteinstrukturer ved højere temperaturer. Denne tilgang kan give funktionelt relevante strukturer og forbedre forståelsen af proteinstrukturers temperaturafhængighed.Yuan-Chih Chang, leder af Academia Sinica Cryo EM-anlægget, demonstrerer proceduren. Begynd med at lave et hul på en centimeter i et 50 millimeter centrifugerør på den lukkede ende. Placer røret i vitrifikationsapparatets kammer ved ultralydsvandudløbet.Indstil vitrifikationsapparatets temperatur til den angivne temperatur, og lad vitrifikationsapparatets kammer nå 55 grader Celsius og 100% relativ luftfugtighed. Lad det stå i mindst en halv time for at stabilisere forholdene, inden eksperimentet startes. Placer vandbadet på en kogeplade, og indstil kogepladen til den ønskede temperatur.Kontroller med et termometer for at sikre, at vandet når 55 grader Celsius. Prøven inkuberes i vandbadet, og pipettespidsen forvarmes på kanten af kogepladen i to minutter eller længere før blottingforsøget. Glød aflader et hult kulstofunderstøttet gitter ved 25 milliampere i 30 sekunder.Anbring forglasningsfilterpapiret i vitrifikationsapparatets kammer tidligst fem minutter før blottingeksperimentet. Inkuber pincetten med gitteret i forglasningsapparatet i to minutter eller længere. Byg ethanbeholderen med ethan i henhold til standardprocedurer, hvilket sikrer, at ethan ikke løber over.Brug en pipette til at påføre syv til ni mikroliter af prøven på gitteret. Vent derefter i et til to sekunder, blotte i et til et og et halvt sekund, og spring hurtigt prøven i flydende ethan. Overfør gitteret fra flydende ethan til kryoboksen opbevaret i flydende nitrogen.Klip gitterene og aflæs dem for at erhverve elektronmikroskop eller Cryo EM-instrument. Brug skærmen på Cryo EM-instrumentet og softwarens lavdosisfunktion til at screene istilstanden på gitteret og fordelingen af prøven på nettet. Hvis kvaliteten af det resulterende gitter ikke er god, skal du gentage processen med gitterforberedelse med forskellige forhold såsom ventetid, blottingtid osv.Hvis kvaliteten af det resulterende gitter er god, skal du gentage de samme trin for at lave gitre ved en anden temperatur. Overfør gitrene af god kvalitet til et Cryo EM-instrument med høj opløsning. Udfør dataindsamling og dataanalyser i henhold til etablerede procedurer.I tilfælde af det vellykkede gitter dannedes en isgradient med tykkere is øverst til venstre på gitteret og tyndere is nederst til højre. Blå og grønne kasser, der er egnede til dataindsamling, blev observeret i det vellykkede net. En lys kontrast blev observeret i det andet gitter.Angiver et tyndt lag, af is eller fravær af is. Kun to kvadrater viste sig at være egnede til dataindsamling i det andet gitter. Et af gitterene bestod af is for det meste i krystalform, hvilket var uegnet til dataindsamling.På den anden side viste det andet gitter, at islaget for det meste var i en amorf tilstand, der var egnet til dataindsamling. Forberedelsen af som en beholder og andre skal være komplet i henhold til et tidspunkt. Tidskontrol og og afslutning af eksperimentet hurtigt og præcist er vigtigst.Afhængigt af de resultater, der opnås ved hjælp af denne protokol, skal forskeren muligvis være mere forsigtig med at oprette de enkle betingelser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Enkeltpartikel-kryo-EM-dataindsamling med scenehældning ved hjælp af Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse af monolagsgrafen på kryo-elektronmikroskopigitter til strukturbestemmelse med høj opløsning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...