Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. Hervé Remigy van Thermo Fisher Scientific voor nuttig advies. De cryo-EM experimenten werden uitgevoerd in de Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM wordt ondersteund door Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) en Taiwan Protein Project (subsidienr. AS-KPQ-109-TPP2). De auteurs bedanken ook mevrouw Hui-Ju Huang voor de hulp bij de monstervoorbereiding.

OPMERKING: Dit protocol heeft tot doel een gemodificeerd commercieel verglazingsapparaat te gebruiken om de cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) monsters voor te bereiden bij specifieke temperaturen, vooral hoger dan 37 °C. De algemene experimentele opzet is weergegeven in figuur 1. Het protocol gebruikt 55 °C als voorbeeld. Voor de specifieke omstandigheden bij andere temperaturen wordt verwezen naar aanvullende tabel 2 in referentie12.
1...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

Zorg er in stap 1 van het protocol voor dat de centrifugebuis goed is geïnstalleerd en niet valt wanneer het experiment aan de gang is. Vanwege de accumulatie van een groot aantal waterdruppels in de kamer, die de adsorptiecapaciteit van het filterpapier kunnen veranderen, wordt aanbevolen dat de totale tijd van het experiment niet langer mag zijn dan 30 minuten nadat de vitrificatieapparaatkamer de evenwichtstemperatuur heeft bereikt. Als de bedrijfstijd langer is dan 30 minuten, moet de operator het filterpapier verva...

De cryo-EM-technologie voor het oplossen van de structuren van eiwitcomplexen is blijven verbeteren, met name in de richting van het verkrijgen van structuren met hoge resolutie 1,2. In de tussentijd is het landschap van de toepassing ervan ook uitgebreid door de monsteromstandigheden te variëren, zoals pH of liganden voorafgaand aan het vitrificatieproces3, waarbij monsterroosters worden voorbereid, gevolgd door dompelbevriezing 4,5. Een andere belangrijke voorwaarde is de temperatuur. Hoewel cryo-EM-experimenten, zoals röntgenkristallografie, worden uitgevoerd bij lage temperaturen, weerspiegelt de structuur die door cryo-EM wordt opgelost de structuur in de oplossingstoestand voorafgaand aan vitrificatie. Tot voor kort gebruikten de meeste cryo-EM-onderzoeken met enkelvoudige deeltjesanalyse (SPA) monsters die op ijs worden bewaard (d.w.z. bij 4 °C) voorafgaand aan vitrificatie6, hoewel een aantal studies monsters gebruiken bij ongeveer kamertemperatuur 7,8,9,10 of zo hoog als 42 °C11. In een recent rapport voerden we temperatuurafhankelijke studies uit van het enzym ketolzuurreductoisomerase (KARI) van het thermofiele archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) bij zes verschillende temperaturen van 4 °C tot 70 °C12. Onze studies suggereren dat het belangrijk is om monsterrasters voor te bereiden op functioneel relevante temperaturen en dat cryo-EM de enige structurele methode is die praktisch haalbaar is voor het oplossen van de structuur van hetzelfde eiwitcomplex bij meerdere temperaturen.
De grootste moeilijkheid voor vitrificatie bij hoge temperaturen is het minimaliseren van dampcondensatie en het bereiken van dun ijs. Hier rapporteren we het gedetailleerde protocol dat wordt gebruikt voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperaturen in onze eerdere studie van de Sso-KARI 12. We gaan ervan uit dat de lezers of kijkers al ervaring hebben met de algemene monstervoorbereiding en gegevensverwerkingsprocedures voor cryo-EM-experimenten en benadrukken de aspecten die relevant zijn voor hoge temperaturen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

De monsterrasters voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) experimenten worden meestal voorbereid bij een temperatuur die optimaal is voor de opslag van biologische monsters, meestal bij 4 °C en soms bij kamertemperatuur. Onlangs ontdekten we dat de eiwitstructuur die bij lage temperatuur wordt opgelost, mogelijk niet functioneel relevant is, met name voor eiwitten uit thermofiele archaea. Er werd een procedure ontwikkeld om eiwitmonsters bij hogere temperaturen (tot 70 °C) voor cryo-EM-analyse voor te bereiden. We toonden aan dat de structuren van monsters die bij hogere temperaturen worden bereid, functioneel relevant en temperatuurafhankelijk zijn. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperatuur, met 55 °C als voorbeeld. Het experiment maakte gebruik van een verglazingsapparaat dat was aangepast met behulp van een extra centrifugebuis en monsters werden geïncubeerd bij 55 °C. De gedetailleerde procedures werden verfijnd om dampcondensatie te minimaliseren en een dunne laag ijs op het rooster te verkrijgen. Voorbeelden van succesvolle en mislukte experimenten worden gegeven.

Het overzicht van de lage vergroting is weergegeven in figuur 5A,B. Paneel A is een voorbeeld van een succesvol raster. Er is een ijsgradiënt van linksboven (dikker) naar rechtsonder (dunner of leeg). Zo'n raster maakt het gemakkelijker om een geschikte dikte van de ijslaag in het middengebied te vinden die geschikt is voor gegevensverzameling, zoals de blauwe en groene dozen. Het rooster B is te droog. De vierkanten in het raster hebben een helder contrast, wat betekent da...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterrasters bij temperaturen tot 70 °C, voorafgaand aan het invriezen van de duik voor cryo-EM-experimenten.

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

De functies van eiwitten zijn temperatuurafhankelijk en zijn optimaal bij de temperatuur. Dit protocol biedt een manier om eiwitstructuren bij hogere temperaturen op te lossen. Deze aanpak kan functioneel relevante structuren bieden en het begrip van de temperatuurafhankelijkheid van eiwitstructuren vergroten.De procedure wordt gedemonstreerd door Yuan-Chih Chang, manager van de Academia Sinica Cryo EM-faciliteit. Begin met het maken van een gat van één centimeter in een centrifugebuis van 50 millimeter aan het gesloten uiteinde. Plaats de buis in de vitrificatieapparaatkamer bij de ultrasone wateruitlaat.Stel de temperatuur van het vitrificatieapparaat in op de opgegeven temperatuur en laat de vitrificatie-apparaatkamer 55 graden Celsius en 100% relatieve vochtigheid bereiken. Laat het minstens een half uur staan om de omstandigheden te stabiliseren voordat u met het experiment begint. Plaats het waterbad op een hete plaat en zet de hete plaat op de gewenste temperatuur.Controleer met een thermometer of het water 55 graden Celsius bereikt. Incubeer het monster in het waterbad en verwarm de pipetpunt op de rand van de hete plaat twee minuten of langer voor het vloeiexperiment. Gloeiend ontlading een gatvormig koolstof ondersteund raster op 25 milliampere gedurende 30 seconden.Plaats het vitrificatiefilterpapier niet eerder dan vijf minuten voor het vloeiexperiment in de vitrificatiekamer. Incubeer het pincet met het rooster in het vitrificatieapparaat gedurende twee minuten of langer. Bouw de ethaancontainer met ethaan volgens standaardprocedures en zorg ervoor dat het ethaan niet overloopt.Gebruik een pipet om zeven tot negen microliter van het monster op het rooster aan te brengen. Wacht vervolgens één tot twee seconden, dep één tot anderhalve seconde en dompel het monster snel in vloeibaar ethaan. Breng het rooster over van vloeibaar ethaan naar de cryobox die is opgeslagen in vloeibare stikstof.Knip de roosters vast en ontlaad ze om een elektronenmicroscoop of Cryo EM-instrument te verkrijgen. Gebruik het beeldscherm van het Cryo EM-instrument en de lage dosisfunctie van de software om de ijsconditie op het rooster en de verdeling van het monster op het rooster te screenen. Als de kwaliteit van het resulterende rooster niet goed is, herhaal dan het proces van rastervoorbereiding met gevarieerde omstandigheden zoals wachttijd, blotting-tijd, enzovoort.Als de kwaliteit van het resulterende raster goed is, herhaalt u dezelfde stappen om rasters met een andere temperatuur te maken. Breng de roosters van goede kwaliteit over naar een Cryo EM-instrument met hoge resolutie. Voer gegevensverzameling en gegevensanalyses uit volgens vastgestelde procedures.In het geval van het succesvolle raster vormde zich een ijsgradiënt met dikker ijs linksboven in het raster en dunner ijs rechtsonder. Blauwe en groene vakjes die geschikt zijn voor gegevensverzameling werden waargenomen in het succesvolle raster. In het andere raster werd een helder contrast waargenomen.Duidend op een dun laagje, van ijs of een afwezigheid van ijs. Slechts twee vierkanten bleken geschikt voor gegevensverzameling in het tweede raster. Een van de rasters bestond voornamelijk uit ijs in de kristalvorm, dat ongeschikt was voor gegevensverzameling.Aan de andere kant toonde het andere raster aan dat de ijslaag zich meestal in een amorfe toestand bevond die geschikt was voor gegevensverzameling. De voorbereiding van de als een container en anderen moet worden voltooid volgens een tijdstip. Tijdcontrole en het snel en nauwkeurig afronden van het experiment zijn het belangrijkst.Afhankelijk van de resultaten die met behulp van dit protocol worden verkregen, moet de onderzoeker mogelijk voorzichtiger zijn bij het instellen van de eenvoudige voorwaarden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...