Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר הרבה רמיגי מתרמו פישר סיינטיפיק על עצות מועילות. ניסויי הקריו-EM בוצעו במתקן האקדמיה סיניקה קריו-EM (ASCEM). ASCEM נתמך על ידי האקדמיה הסינית (מענק לא. AS-CFII-108-110) ופרויקט החלבון של טייוואן (מענק מס' AS-KPQ-109-TPP2). המחברים מודים גם לגב' הוי-ג'ו הואנג על הסיוע בהכנת הדגימה.

הערה: פרוטוקול זה נועד להשתמש במנגנון ויטריפיקציה מסחרי שונה כדי להכין את דגימות מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים (cryo-EM) בטמפרטורות ספציפיות, גבוהות במיוחד מ-37 מעלות צלזיוס. מערך הניסוי הכולל מוצג באיור 1. הפרוטוקול משתמש ב-55 מעלות צלזיוס כדוגמה. לגבי התנאים הספציפיים בטמפרטו?...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

בשלב 1 של הפרוטוקול, ודא שצינור הצנטריפוגה הותקן היטב ואינו נופל כאשר הניסוי בעיצומו. בשל הצטברות של מספר רב של טיפות מים בתא, אשר יכול לשנות את יכולת ספיחה של נייר הסינון, מומלץ כי הזמן הכולל של הניסוי לא יעלה על 30 דקות לאחר שתא מנגנון הוויטריפיקציה הגיע לטמפרטורת שיווי המשקל. אם זמן הפעולה ...

טכנולוגיית cryo-EM לפתרון מבנים של קומפלקסים חלבונים המשיכה להשתפר, במיוחד בכיוון של קבלת מבנים ברזולוציה גבוהה 1,2. בינתיים, הנוף של היישום שלה הורחב גם על ידי שינוי תנאי הדגימה כגון pH או ליגנדות לפני תהליך vitrification3, הכולל הכנת רשתות דגימה ואחריו הקפאת צלילה 4,5. תנאי חשוב נוסף הוא הטמפרטורה. למרות שניסויי cryo-EM, כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מבוצעים בטמפרטורות נמוכות, המבנה שנפתר על ידי cryo-EM משקף את המבנה במצב התמיסה לפני הוויטריפיקציה. עד לאחרונה, רוב מחקרי הקריו-EM של ניתוח חלקיקים בודדים (SPA) משתמשים בדגימות שנשמרות על קרח (כלומר, ב-4 מעלות צלזיוס) לפני ויטריפיקציה6, אם כי מספר מחקרים משתמשים בדגימות בטמפרטורת החדרסביב 7,8,9,10 או עד 42 מעלות צלזיוס 11. בדו"ח שפורסם לאחרונה, ביצענו מחקרים תלויי טמפרטורה של האנזים קטול-חומצה רדוקטויזומראז (KARI) מהארכיאון התרמופילי סולפולובוס סולפטריקוס (Sso) בשש טמפרטורות שונות מ-4 מעלות צלזיוס עד 70 מעלות צלזיוס12. המחקרים שלנו מצביעים על כך שחשוב להכין רשתות דגימה בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה פונקציונלית וכי cryo-EM היא השיטה המבנית היחידה האפשרית למעשה לפתרון המבנה של אותו קומפלקס חלבונים בטמפרטורות מרובות.
הקושי העיקרי לוויטריפיקציה בטמפרטורות גבוהות הוא למזער את עיבוי האדים ולהשיג קרח דק. כאן אנו מדווחים על הפרוטוקול המפורט המשמש להכנת רשתות מדגם בטמפרטורות גבוהות במחקר הקודם שלנו על Sso-KARI 12. אנו מניחים שהקוראים או הצופים כבר מנוסים בהליכי הכנת המדגם הכוללים ועיבוד הנתונים לניסויים cryo-EM ומדגישים את ההיבטים הרלוונטיים לטמפרטורה גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

רשתות הדגימות לניסויים במיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) מוכנות בדרך כלל בטמפרטורה אופטימלית לאחסון דגימות ביולוגיות, לרוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולעיתים בטמפרטורת החדר. לאחרונה גילינו שמבנה החלבון שנפתר בטמפרטורה נמוכה עשוי שלא להיות רלוונטי מבחינה תפקודית, במיוחד עבור חלבונים מארכאה תרמופילית. פותח הליך להכנת דגימות חלבון בטמפרטורות גבוהות יותר (עד 70 מעלות צלזיוס) לניתוח cryo-EM. הראינו שהמבנים מדגימות שהוכנו בטמפרטורות גבוהות יותר רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ותלויים בטמפרטורה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת רשתות מדגם בטמפרטורה גבוהה, תוך שימוש ב- 55 מעלות צלזיוס כדוגמה. הניסוי עשה שימוש במנגנון ויטריפיקציה ששונה באמצעות צינור צנטריפוגה נוסף, ודגימות דוגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. הנהלים המפורטים היו מכווננים כדי למזער את עיבוי האדים ולקבל שכבה דקה של קרח על הרשת. דוגמאות לניסויים מוצלחים ולא מוצלחים מסופקים.

סקירת ההגדלה הנמוכה מוצגת באיור 5A,B. לוח A הוא דוגמה לרשת מוצלחת. יש שיפוע קרח משמאל למעלה (עבה יותר) לימין למטה (דק יותר או ריק). רשת כזו מקלה על מציאת עובי מתאים של שכבת הקרח באזור האמצעי המתאים לאיסוף נתונים, כגון הקופסאות הכחולות והירוקות. הרשת B יבשה מדי. לריבועים ב...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת רשתות דגימה בטמפרטורות של עד 70 מעלות צלזיוס, לפני שקיפאון הצניחה לניסויי cryo-EM.

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

הפונקציות של חלבונים הן תלויות טמפרטורה והן אופטימליות בטמפרטורה. פרוטוקול זה מספק דרך לפתור מבנים חלבוניים בטמפרטורות גבוהות יותר. גישה זו יכולה לספק מבנים רלוונטיים מבחינה פונקציונלית ולשפר את ההבנה של התלות בטמפרטורה של מבנים חלבוניים.מי שידגים את ההליך יהיה יואן-צ'יה צ'אנג, מנהל המתקן של האקדמיה סיניקה קריו EM. התחל על ידי יצירת חור של סנטימטר אחד בצינור צנטריפוגה של 50 מ"מ בקצה הסגור שלו. מקם את הצינור בתא מנגנון הוויטריפיקציה בשקע המים העל-קולי.הגדר את טמפרטורת מנגנון הוויטריפיקציה לטמפרטורה שצוינה, ואפשר לתא מנגנון הוויטריפיקציה להגיע ל-55 מעלות צלזיוס וללחות יחסית של 100%. תן לו לעמוד לפחות חצי שעה כדי לייצב את התנאים לפני תחילת הניסוי. מניחים את אמבט המים על פלטה חמה ומכוונים את הצלחת החמה לטמפרטורה הרצויה.בדוק עם מדחום כדי לוודא שהמים מגיעים ל -55 מעלות צלזיוס. דגירה של הדגימה באמבט המים, ומחממים מראש את קצה הפיפטה בקצה הפלטה החמה במשך שתי דקות או יותר לפני ניסוי ההכתמה. זוהר לפרוק רשת נתמכת פחמן חורי ב 25 מיליאמפר במשך 30 שניות.הכניסו את נייר הסינון של הוויטריפיקציה לתא מנגנון הוויטריפיקציה לא לפני חמש דקות לפני ניסוי ההכתמה. לדגום את הפינצטה עם הרשת במנגנון vitrification במשך שתי דקות או יותר. בנה את מיכל האתאן עם אתאן על פי נהלים סטנדרטיים, כדי להבטיח שהאתאן לא יעלה על גדותיו.השתמש פיפטה כדי להחיל שבעה עד תשעה microliters של הדגימה על הרשת. לאחר מכן המתן שנייה עד שתיים, הכתם למשך שנייה עד שנייה וחצי, וצלל במהירות את הדגימה לתוך אתאן נוזלי. מעבירים את הרשת מאתאן נוזלי לקופסת הקריו המאוחסנת בחנקן נוזלי.גזור את הרשתות ופורק אותן כדי לרכוש מיקרוסקופ אלקטרונים או מכשיר Cryo EM. השתמש במסך התצוגה של מכשיר ה- Cryo EM ובפונקציית המינון הנמוך של התוכנה, כדי לסנן את מצב הקרח ברשת ואת התפלגות הדגימה ברשת. אם איכות הרשת המתקבלת אינה טובה, חזור על תהליך הכנת הרשת בתנאים מגוונים כגון זמן המתנה, זמן הכתמה וכו '.אם איכות הרשת המתקבלת טובה, חזור על אותם שלבים כדי ליצור רשתות בטמפרטורה שונה. העבר את הרשתות באיכות טובה למכשיר Cryo EM ברזולוציה גבוהה. ביצוע איסוף נתונים וניתוח נתונים על פי נהלים שנקבעו.במקרה של הרשת המוצלחת, נוצר שיפוע קרח עם קרח עבה יותר בפינה השמאלית העליונה של הרשת וקרח דק יותר בפינה הימנית התחתונה. קופסאות כחולות וירוקות המתאימות לאיסוף נתונים נצפו ברשת המוצלחת. ניגוד בהיר נצפה ברשת השנייה.מציין שכבה דקה, של קרח או היעדר קרח. רק שני ריבועים נמצאו מתאימים לאיסוף נתונים ברשת השנייה. אחת הרשתות כללה קרח בעיקר בצורת גבישין, שלא היה מתאים לאיסוף נתונים.מצד שני, הרשת השנייה הראתה ששכבת הקרח נמצאת ברובה במצב אמורפי המתאים לאיסוף נתונים. הכנת המיכל ואחרים צריכה להיות שלמה על פי נקודת זמן. בקרת זמן וסיום הניסוי במהירות ובדייקנות הם החשובים ביותר.בהתאם לתוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה, ייתכן שהחוקר יצטרך להיות זהיר יותר בהגדרת התנאים הפשוטים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...