Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
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Gli autori ringraziano il Dr. Hervé Remigy di Thermo Fisher Scientific per gli utili consigli. Gli esperimenti crio-EM sono stati eseguiti presso l'Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM è sostenuto da Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (sovvenzione n. AS-KPQ-109-TPP2). Gli autori ringraziano anche la signora Hui-Ju Huang per l'assistenza nella preparazione del campione.

NOTA: Questo protocollo mira ad utilizzare un apparato di vetrificazione commerciale modificato per preparare i campioni di microscopia crioelettronica (crio-EM) a temperature specifiche, in particolare superiori a 37 °C. La configurazione sperimentale complessiva è mostrata nella Figura 1. Il protocollo utilizza 55 °C come esempio. Per le condizioni specifiche ad altre temperature, fare riferimento alla tabella supplementare 2 nel riferimento12.
<p class="jov...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

Nella fase 1 del protocollo, assicurarsi che il tubo della centrifuga sia stato installato bene e non cada quando l'esperimento è in corso. A causa dell'accumulo di un gran numero di goccioline d'acqua nella camera, che potrebbero modificare la capacità di adsorbimento della carta da filtro, si raccomanda che il tempo complessivo dell'esperimento non superi i 30 minuti dopo che la camera dell'apparato di vetrificazione ha raggiunto la temperatura di equilibrio. Se il tempo di funzionamento supera i 30 minuti, l'operato...

La tecnologia crio-EM per risolvere le strutture dei complessi proteici ha continuato a migliorare, in particolare nella direzione di ottenere strutture ad alta risoluzione 1,2. Nel frattempo, anche il panorama della sua applicazione è stato ampliato variando le condizioni del campione come pH o leganti prima del processo di vetrificazione3, che prevede la preparazione di griglie di campionamento seguite dal congelamento a tuffo 4,5. Un'altra condizione importante è la temperatura. Sebbene gli esperimenti crio-EM, come la cristallografia a raggi X, vengano eseguiti a basse temperature, la struttura risolta dalla crio-EM riflette la struttura allo stato di soluzione prima della vetrificazione. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli studi crio-EM di analisi di singole particelle (SPA) utilizza campioni che vengono conservati sul ghiaccio (cioè a 4 °C) prima della vetrificazione6, sebbene un certo numero di studi utilizzi campioni a temperatura ambiente di circa 7,8,9,10 o fino a 42 °C 11. In un recente rapporto, abbiamo eseguito studi dipendenti dalla temperatura dell'enzima cheto-acido riduttoisomerasi (KARI) dall'archeone termofilo Sulfolobus solfataricus (Sso) a sei diverse temperature da 4 ° C a 70 ° C12. I nostri studi suggeriscono che è importante preparare griglie di campioni a temperature funzionalmente rilevanti e che la crio-EM è l'unico metodo strutturale praticamente fattibile per risolvere la struttura dello stesso complesso proteico a più temperature.
La principale difficoltà per la vetrificazione ad alte temperature è ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere ghiaccio sottile. Qui riportiamo il protocollo dettagliato utilizzato per la preparazione di griglie campione ad alte temperature nel nostro precedente studio di Sso-KARI 12. Partiamo dal presupposto che i lettori o gli spettatori abbiano già esperienza nella preparazione complessiva del campione e nelle procedure di elaborazione dei dati per gli esperimenti crio-EM e sottolineiamo gli aspetti rilevanti per l'alta temperatura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

Le griglie di campioni per esperimenti di crio-microscopia elettronica (crio-EM) sono solitamente preparate ad una temperatura ottimale per la conservazione di campioni biologici, per lo più a 4 °C e occasionalmente a temperatura ambiente. Recentemente, abbiamo scoperto che la struttura proteica risolta a bassa temperatura potrebbe non essere funzionalmente rilevante, in particolare per le proteine degli archei termofili. È stata sviluppata una procedura per preparare campioni proteici a temperature più elevate (fino a 70 °C) per l'analisi crio-EM. Abbiamo dimostrato che le strutture provenienti da campioni preparati a temperature più elevate sono funzionalmente rilevanti e dipendenti dalla temperatura. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni ad alta temperatura, usando 55 °C come esempio. L'esperimento si è avvalso di un apparecchio di vetrificazione modificato mediante una provetta da centrifuga supplementare e i campioni sono stati incubati a 55 °C. Le procedure dettagliate sono state messe a punto per ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere un sottile strato di ghiaccio sulla griglia. Vengono forniti esempi di esperimenti riusciti e falliti.

La panoramica del basso ingrandimento è mostrata nella Figura 5A,B. Il pannello A è un esempio di griglia di successo. C'è un gradiente di ghiaccio dall'alto a sinistra (più spesso) al basso a destra (più sottile o vuoto). Tale griglia rende più facile trovare uno spessore appropriato dello strato di ghiaccio nell'area centrale adatto alla raccolta dei dati, come le caselle blu e verdi. La griglia B è troppo asciutta. I quadrati nella griglia hanno un contrasto lumino...

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Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Le funzioni delle proteine dipendono dalla temperatura e sono ottimali alla temperatura. Questo protocollo fornisce un modo per risolvere le strutture proteiche a temperature più elevate. Questo approccio può fornire strutture funzionalmente rilevanti e migliorare la comprensione della dipendenza dalla temperatura delle strutture proteiche.A dimostrare la procedura sarà Yuan-Chih Chang, Manager della struttura Academia Sinica Cryo EM. Inizia facendo un foro di un centimetro in un tubo di centrifuga da 50 millimetri sulla sua estremità chiusa. Posizionare il tubo nella camera dell'apparato di vetrificazione all'uscita dell'acqua ad ultrasuoni.Impostare la temperatura dell'apparecchio di vetrificazione alla temperatura specificata e consentire alla camera dell'apparecchio di vetrificazione di raggiungere 55 gradi Celsius e il 100% di umidità relativa. Lasciare riposare per almeno mezz'ora per stabilizzare le condizioni prima di iniziare l'esperimento. Posizionare il bagno d'acqua su una piastra riscaldante e impostare la piastra calda alla temperatura desiderata.Controllare con un termometro per assicurarsi che l'acqua raggiunga i 55 gradi Celsius. Incubare il campione a bagnomaria e preriscaldare la punta della pipetta sul bordo della piastra riscaldante per due minuti o più prima dell'esperimento di blotting. Glow scarica una griglia supportata da carbonio holey a 25 milliampere per 30 secondi.Posizionare la carta da filtro per vetrificazione nella camera dell'apparecchio di vetrificazione non prima di cinque minuti prima dell'esperimento di blotting. Incubare le pinzette con la griglia nell'apparecchio di vitrificazione per due minuti o più. Costruire il contenitore di etano con etano secondo le procedure standard, assicurandosi che l'etano non trabocchi.Utilizzare una pipetta per applicare da sette a nove microlitri del campione alla griglia. Quindi attendere uno o due secondi, asciugare per uno o un secondo e mezzo e immergere rapidamente il campione nell'etano liquido. Trasferire la griglia dall'etano liquido alla crioscatola immagazzinata in azoto liquido.Aggancia le griglie e scaricale per acquisire il microscopio elettronico o lo strumento Cryo EM. Utilizzare lo schermo dello strumento Cryo EM e la funzione a basso dosaggio del software, per schermare le condizioni del ghiaccio sulla griglia e la distribuzione del campione sulla griglia. Se la qualità della griglia risultante non è buona, ripetere il processo di preparazione della griglia con varie condizioni come tempi di attesa, tempi di asciugatura, eccetera.Se la qualità della griglia risultante è buona, ripetere gli stessi passaggi per creare griglie a una temperatura diversa. Trasferisci le griglie di buona qualità su uno strumento Cryo EM ad alta risoluzione. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati secondo procedure stabilite.Nel caso della griglia di successo, si è formato un gradiente di ghiaccio con ghiaccio più spesso in alto a sinistra della griglia e ghiaccio più sottile in basso a destra. Le caselle blu e verdi adatte alla raccolta dei dati sono state osservate nella griglia di successo. Un contrasto luminoso è stato osservato nell'altra griglia.Indica uno strato sottile, di ghiaccio o un'assenza di ghiaccio. Solo due quadrati sono risultati adatti per la raccolta dei dati nella seconda griglia. Una delle griglie consisteva principalmente di ghiaccio sotto forma di cristallino, che non era adatto per la raccolta dei dati.D'altra parte, l'altra griglia ha mostrato che lo strato di ghiaccio era per lo più in uno stato amorfo adatto alla raccolta dei dati. La preparazione del contenitore e degli altri deve essere completa in base a un punto temporale. Il controllo del tempo e la finitura dell'esperimento in modo rapido e preciso sono molto importanti.A seconda dei risultati ottenuti utilizzando questo protocollo, il ricercatore potrebbe dover essere più attento nell'impostare le semplici condizioni.

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Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione

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