Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
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著者らは、有用なアドバイスを提供してくれたサーモフィッシャーサイエンティフィックのHervé Remigy博士に感謝します。クライオEM実験は中央研究院クライオEM施設(ASCEM)で実施しました。ASCEMは中央研究院の支援を受けています(助成金番号。AS-CFII-108-110)および台湾タンパク質プロジェクト(助成金番号。AS-KPQ-109-TPP2)。著者らはまた、サンプル調製の支援をしてくれたHui-Ju Huang氏にも感謝しています。

注:このプロトコルは、特定の温度、特に37°Cを超える温度でクライオ電子顕微鏡(クライオEM)サンプルを調製するために、変更された市販のガラス化装置を使用することを目的としています。 全体的な実験セットアップを 図1に示します。プロトコルは例として55°Cを使用します。その他の温度での具体的な条件については、参考文献12の補足表2を参照?...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

プロトコルのステップ1では、遠心管がしっかりと取り付けられており、実験の進行中に落下しないことを確認してください。チャンバー内に多数の水滴が蓄積し、ろ紙の吸着能力が変化する可能性があるため、ガラス化装置チャンバーが平衡温度に達した後、実験の全体的な時間が30分を超えないようにすることをお勧めします。操作時間が30分を超える場合、オペレーターはろ紙を交換し?...

タンパク質複合体の構造を解明するためのクライオEM技術は、特に高分解能の構造を得る方向に改善を続けています1,2。その間、そのアプリケーションの展望は、サンプルグリッドの準備とそれに続くプランジ凍結を含むガラス化プロセス3の前にpHやリガンドなどのサンプル条件を変えることによっても拡大されました4,5。もう一つの重要な条件は温度です。クライオ電子顕微鏡実験は、X線結晶構造解析と同様に低温で行われますが、クライオ電子顕微鏡で解かれた構造は、ガラス化前の溶液状態での構造を反映しています。最近まで、単粒子分析(SPA)クライオEM研究の大部分は、ガラス化の前に氷上(すなわち4°C)に保たれたサンプルを使用していますが6、多くの研究では、室温付近の7、8、9、10または42°Cまでのサンプルを使用しています11。最近の報告では、好熱性古細菌スルフォロブスソルファタリクス(Sso)由来の酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)の温度依存的研究を4°Cから70°Cまでの6つの異なる温度で実施しました12。私たちの研究は、機能的に関連する温度でサンプルグリッドを準備することが重要であり、クライオEMが複数の温度で同じタンパク質複合体の構造を解くために実用的に実行可能な唯一の構造方法であることを示唆しています。
高温でのガラス化の主な困難は、蒸気の凝縮を最小限に抑え、薄い氷を実現することです。ここでは、 Sso-KARI 12の以前の研究で高温でサンプルグリッドを準備するために使用された詳細なプロトコルを報告します。読者または視聴者は、クライオEM実験のための全体的なサンプル調製およびデータ処理手順をすでに経験していることを前提とし、高温に関連する側面を強調します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)実験用のサンプルグリッドは、通常、生物学的サンプルの保存に最適な温度、主に4°C、場合によっては室温で調製されます。最近、低温で解かれたタンパク質構造は、特に好熱性古細菌のタンパク質にとって、機能的に関連性がない可能性があることを発見しました。クライオEM分析のために、より高い温度(最大70°C)でタンパク質サンプルを調製するための手順が開発されました。我々は、より高い温度で調製されたサンプルの構造が機能的に関連性があり、温度に依存することを示した。ここでは、55°Cを例に、高温でサンプルグリッドを調製するための詳細なプロトコルについて説明します。実験では、追加の遠沈管を使用して修正したガラス化保存装置を利用し、サンプルを55°Cでインキュベートしました。 詳細な手順は、蒸気の凝縮を最小限に抑え、グリッド上に薄い氷の層を得るために微調整されました。成功した実験と失敗した実験の例が提供されています。

低倍率の概要を 図5A、Bに示します。パネル A は、成功したグリッドの例です。左上(厚い)から右下(薄いまたは空)への氷のグラデーションがあります。このようなグリッドにより、青や緑のボックスなど、データ収集に適した中央領域の氷層の適切な厚さを簡単に見つけることができます。グリッドBが乾燥しすぎています。グリッド内の正方形のコントラ?...

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Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

この論文は、クライオEM実験のために急落凍結する前に、70°Cという高い温度でサンプルグリッドを準備するための詳細なプロトコルを提供します。

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

タンパク質の機能は温度に依存し、温度に最適です。このプロトコルは、より高い温度でタンパク質構造を解決する方法を提供します。このアプローチは、機能的に関連する構造を提供し、タンパク質構造の温度依存性の理解を深めることができます。手順のデモンストレーションは、中央研究院クライオEM施設のマネージャーであるYuan-Chih Changです。閉じた端にある50ミリメートルの遠沈管に1センチメートルの穴を開けることから始めます。超音波水出口のガラス化保存装置チャンバーにチューブを置きます。ガラス化保存装置の温度を規定温度に設定し、ガラス化槽を摂氏55度、相対湿度100%にします。実験を開始する前に、条件を安定させるために少なくとも30分間放置します。ウォーターバスをホットプレートに置き、ホットプレートを希望の温度に設定します。温度計で水が摂氏55度に達することを確認します。サンプルをウォーターバスでインキュベートし、ブロッティング実験の前にホットプレートの端にあるピペットチップを2分以上予熱します。グローは、穴のあるカーボン支持グリッドを25ミリアンペアで30秒間放電します。吸い取り実験の5分前までにガラス化ろ紙をガラス化装置チャンバーに入れます。ピンセットをガラス化装置のグリッドで2分以上インキュベートします。標準的な手順に従ってエタンでエタン容器を構築し、エタンがオーバーフローしないようにします。ピペットを使用して、7〜9マイクロリットルのサンプルをグリッドに適用します。次に、1〜2秒待ち、1〜1秒半ブロットして、サンプルを液体エタンにすばやく浸します。グリッドを液体エタンから液体窒素に保存されたクライオボックスに移します。グリッドをクリップしてアンロードし、電子顕微鏡またはクライオEM装置を取得します。クライオEM装置の表示画面とソフトウェアの低線量機能を使用して、グリッド上の氷の状態とグリッド上のサンプルの分布をスクリーニングします。得られたグリッドの品質が良くない場合は、待機時間、ブロッティング時間などのさまざまな条件でグリッド準備のプロセスを繰り返します。結果のグリッドの品質が良好な場合は、同じ手順を繰り返して、異なる温度でグリッドを作成します。高品質のグリッドを高解像度のクライオEM装置に転送します。確立された手順に従ってデータ収集とデータ分析を実行します。成功したグリッドの場合、グリッドの左上に厚い氷、右下に薄い氷で氷の勾配が形成されました。データ収集に適した青と緑のボックスが成功したグリッドで観察されました。もう一方のグリッドでは明るいコントラストが観察されました。氷の薄い層または氷の欠如を示します。2番目のグリッドでのデータ収集に適しているのは2つの正方形のみであることがわかりました。グリッドの1つは、主にクリスタリン型の氷で構成されており、データ収集には適していませんでした。一方、もう一方のグリッドは、氷層がほとんどデータ収集に適したアモルファス状態にあることを示しました。ASコンテナなどの準備は、時点に応じて完了する必要があります。時間管理と実験を迅速かつ正確に終了することが最も重要です。このプロトコルを使用して得られた結果によっては、研究者は単純な条件を設定する際により注意しなければならない場合があります。

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