Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
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저자는 유용한 조언을 해준 Thermo Fisher Scientific의 Hervé Remigy 박사에게 감사드립니다. Cryo-EM 실험은 Academia Sinica Cryo-EM Facility(ASCEM)에서 수행되었습니다. ASCEM은 Academia Sinica(Grant No. AS-CFII-108-110) 및 대만 단백질 프로젝트 (보조금 번호. AS-KPQ-109-TPP2). 저자는 또한 샘플 준비에 도움을 준 Ms. Hui-Ju Huang에게 감사를 표합니다.

참고: 이 프로토콜은 수정된 상업용 유리화 장치를 사용하여 특정 온도, 특히 37°C 이상의 온도에서 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 샘플을 준비하는 것을 목표로 합니다. 전체 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜은 55°C를 예로 사용합니다. 다른 온도에서의 특정 조건은 참고자료12의 보충 표 2를 참조하십시오.
1. 유리화 장치의 제...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

프로토콜의 1단계에서 원심분리기 튜브가 잘 설치되었고 실험이 진행 중일 때 떨어지지 않는지 확인하십시오. 챔버에 많은 수의 물방울이 축적되어 여과지의 흡착 용량을 변경할 수 있기 때문에 유리화 장치 챔버가 평형 온도에 도달 한 후 실험의 전체 시간이 30 분을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 작동 시간이 30분을 초과하면 작업자는 여과지를 교체하고 캐빈이 온도와 습도의 균형을 다시 맞출...

단백질 복합체의 구조를 해결하기 위한 Cryo-EM 기술은 특히 고해상도 구조 1,2를 얻는 방향으로 지속적으로 개선되었습니다. 한편, 유리화 공정3 이전에 pH 또는 리간드와 같은 샘플 조건을 변경하여 적용 범위가 확장되었으며, 여기에는 샘플 그리드 준비 후 플런지 동결 4,5가 포함됩니다. 또 다른 중요한 조건은 온도입니다. X선 결정학과 같은 Cryo-EM 실험은 저온에서 수행되지만 Cryo-EM으로 해결된 구조는 유리화 전 용액 상태의 구조를 반영합니다. 최근까지 대부분의 단일 입자 분석(SPA) Cryo-EM 연구는유리화6 전에 얼음 위(즉, 4°C)에 보관된 샘플을 사용하지만 많은 연구에서 약실온 7,8,9,10 또는 최고 42°C에서 샘플을 사용합니다11. 최근 보고서에서 우리는 4 ° C에서 70 ° C까지의 6 가지 온도에서 고온 성 고세균 설포로부스 솔 파타 리쿠스 (Sso)의 효소 케톨산 환원 이소머 라제 (KARI)에 대한 온도 의존적 연구를 수행했습니다12. 당사의 연구에 따르면 기능적으로 관련된 온도에서 샘플 그리드를 준비하는 것이 중요하며 Cryo-EM은 여러 온도에서 동일한 단백질 복합체의 구조를 해석하는 데 실질적으로 실현 가능한 유일한 구조적 방법입니다.
고온에서 유리화의 주요 어려움은 증기 응축을 최소화하고 얇은 얼음을 얻는 것입니다. 여기에서는 Sso-KARI 12에 대한 이전 연구에서 고온에서 샘플 그리드를 준비하는 데 사용된 자세한 프로토콜을 보고합니다. 독자 또는 관찰자가 Cryo-EM 실험을 위한 전체 샘플 준비 및 데이터 처리 절차에 이미 경험이 있다고 가정하고 고온과 관련된 측면을 강조합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 실험을 위한 샘플 그리드는 일반적으로 생물학적 시료 보관에 최적의 온도(대부분 4°C, 때로는 실온)에서 준비됩니다. 최근에 우리는 저온에서 해결된 단백질 구조가 특히 고온성 고세균의 단백질에 대해 기능적으로 관련이 없을 수 있음을 발견했습니다. Cryo-EM 분석을 위해 더 높은 온도(최대 70°C)에서 단백질 샘플을 준비하는 절차가 개발되었습니다. 우리는 더 높은 온도에서 준비된 샘플의 구조가 기능적으로 관련이 있고 온도에 의존한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 55°C를 예로 들어 고온에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 실험은 추가 원심분리 튜브를 사용하여 변형된 유리화 장치를 사용하여 샘플을 55°C에서 배양했습니다. 세부 절차는 증기 응축을 최소화하고 그리드에 얇은 얼음 층을 얻기 위해 미세 조정되었습니다. 성공한 실험과 실패한 실험의 예가 제공됩니다.

저배율 개요는 그림 5A, B에 나와 있습니다. 패널 A는 성공적인 그리드의 예입니다. 왼쪽 위 (두꺼운)에서 오른쪽 아래 (더 얇거나 비어 있음)까지 얼음 그라데이션이 있습니다. 이러한 그리드는 청색 및 녹색 박스와 같은 데이터 수집에 적합한 중간 영역에서 적절한 두께의 얼음층을 쉽게 찾을 수 있게 한다. 그리드 B가 너무 건조합니다. 그리드의 사각형은 밝은 ?...

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Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

이 백서는 Cryo-EM 실험을 위한 플런지 동결 전에 70°C의 높은 온도에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

단백질의 기능은 온도에 따라 다르며 온도에서 최적입니다. 이 프로토콜은 더 높은 온도에서 단백질 구조를 해결하는 방법을 제공합니다. 이 접근법은 기능적으로 관련된 구조를 제공하고 단백질 구조의 온도 의존성에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 Academia Sinica Cryo EM 시설의 관리자 인 Yuan-Chih Chang입니다. 닫힌 끝의 50mm 원심 분리기 튜브에 1cm 구멍을 만드는 것으로 시작하십시오. 초음파 물 출구에서 유리화 장치 약실에 있는 관을 두십시오.유리화 장치 온도를 지정된 온도로 설정하고 유리화 장치 챔버가 섭씨 55도 및 100% 상대 습도에 도달하도록 합니다. 실험을 시작하기 전에 조건을 안정화하기 위해 적어도 30 분 동안 그대로 두십시오. 수조를 핫 플레이트에 놓고 핫 플레이트를 원하는 온도로 설정합니다.온도계로 물이 섭씨 55도에 도달하는지 확인하십시오. 샘플을 수조에서 배양하고, 블로팅 실험 전에 핫플레이트의 가장자리에 있는 피펫 팁을 2분 이상 예열한다. 글로우는 구멍이 많은 탄소 지지 그리드를 25밀리암페어에서 30초 동안 방전합니다.유리화 여과지를 블로팅 실험 5분 이내에 유리화 장치 챔버에 넣습니다. 유리화 장치에서 그리드와 함께 핀셋을 2 분 이상 배양하십시오. 표준 절차에 따라 에탄으로 에탄 용기를 구축하여 에탄이 넘치지 않도록하십시오.피펫을 사용하여 7-9 마이크로 리터의 샘플을 그리드에 적용하십시오. 다음 1 2 초 동안 기다렸다가, 1 초에서 1 및 30 초 동안 얼룩을 뽑고, 액체 에탄으로 표본을 빨리 던지십시오. 액체 에탄에서 액체 질소에 저장된 냉동 상자로 그리드를 옮깁니다.그리드를 클립하고 언로드하여 전자 현미경 또는 Cryo EM 기기를 획득합니다. Cryo EM 기기의 디스플레이 화면과 소프트웨어의 저선량 기능을 사용하여 그리드의 얼음 상태와 그리드의 샘플 분포를 스크리닝합니다. 결과 그리드의 품질이 좋지 않으면 대기 시간, 블로팅 시간 등과 같은 다양한 조건으로 그리드 준비 과정을 반복하십시오.결과 그리드의 품질이 좋으면 동일한 단계를 반복하여 다른 온도에서 그리드를 만듭니다. 양질의 그리드를 고해상도 Cryo EM 기기로 전송합니다. 확립된 절차에 따라 데이터 수집 및 데이터 분석을 수행합니다.성공적인 그리드의 경우, 그리드의 왼쪽 상단에 더 두꺼운 얼음과 오른쪽 하단에 더 얇은 얼음으로 얼음 그라데이션이 형성되었습니다. 데이터 수집에 적합한 파란색 및 녹색 상자가 성공적인 그리드에서 관찰되었습니다. 다른 그리드에서 밝은 대비가 관찰되었습니다.얇은 층, 얼음 또는 얼음이 없음을 나타냅니다. 두 번째 그리드에서 데이터 수집에 적합한 것으로 확인된 사각형은 두 개뿐입니다. 그리드 중 하나는 대부분 결정질 형태의 얼음으로 구성되어 데이터 수집에 적합하지 않았습니다.반면에, 다른 그리드는 얼음층이 대부분 데이터 수집에 적합한 무정형 상태임을 보여주었다. 용기 및 기타의 준비는 시점에 따라 완료되어야합니다. 시간 제어와 실험을 빠르고 정확하게 완료하는 것이 가장 중요합니다.이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과에 따라 연구원은 간단한 조건을 설정하는 데 더 주의해야 할 수도 있습니다.

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