Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Hervé Remigy fra Thermo Fisher Scientific for nyttige råd. Kryo-EM-eksperimentene ble utført ved Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM er støttet av Academia Sinica (Grant nr. AS-CFII-108-110) og Taiwan Protein Project (Grant nr. AS-KPQ-109-TPP2). Forfatterne takker også Hui-Ju Huang for hjelpen med prøveprepareringen.

MERK: Denne protokollen tar sikte på å bruke et modifisert kommersielt vitrifikasjonsapparat for å forberede kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prøvene ved bestemte temperaturer, spesielt høyere enn 37 ° C. Det samlede eksperimentelle oppsettet er vist i figur 1. Protokollen bruker 55 °C som eksempel. For de spesifikke forholdene ved andre temperaturer, se tilleggstabell 2 i referanse12.
1. Klargjøring av vitrifikasjonsapparatet
<...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

I trinn 1 i protokollen må du kontrollere at sentrifugerøret er installert godt og ikke faller når eksperimentet pågår. På grunn av akkumulering av et stort antall vanndråper i kammeret, noe som kan endre adsorpsjonskapasiteten til filterpapiret, anbefales det at den totale tiden for forsøket ikke overstiger 30 minutter etter at vitrifikasjonsapparatkammeret nådde likevektstemperaturen. Hvis driftstiden overstiger 30 minutter, må operatøren bytte filterpapir og vente på at hytta balanserer temperatur og fukti...

Kryo-EM-teknologien for å løse strukturene til proteinkomplekser har fortsatt å forbedre seg, spesielt i retning av å oppnå høyoppløselige strukturer 1,2. I mellomtiden har landskapet av applikasjonen også blitt utvidet ved å variere prøveforholdene som pH eller ligander før vitrifiseringsprosessen3, som innebærer fremstilling av prøvegitter etterfulgt av stupfrysing 4,5. En annen viktig betingelse er temperaturen. Selv om kryo-EM-eksperimenter, som røntgenkrystallografi, utføres ved lave temperaturer, reflekterer strukturen løst av cryo-EM strukturen ved løsningstilstanden før vitrifisering. Inntil nylig bruker flertallet av kryo-EM-studier (Single Particle Analysis) prøver som holdes på is (dvs. ved 4 ° C) før vitrifisering6, selv om en rekke studier bruker prøver ved rundt romtemperatur 7,8,9,10 eller så høyt som 42 ° C 11. I en fersk rapport utførte vi temperaturavhengige studier av enzymet ketolsyrereduktoisomerase (KARI) fra den termofile archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) ved seks forskjellige temperaturer fra 4 ° C til 70 ° C12. Våre studier tyder på at det er viktig å forberede prøvegitter ved funksjonelt relevante temperaturer, og at cryo-EM er den eneste strukturelle metoden som er praktisk gjennomførbar for å løse strukturen til det samme proteinkomplekset ved flere temperaturer.
Den største vanskeligheten for vitrifisering ved høye temperaturer er å minimere dampkondens og oppnå tynn is. Her rapporterer vi den detaljerte protokollen som ble brukt til å forberede prøvenett ved høye temperaturer i vår tidligere studie av Sso-KARI 12. Vi antar at leserne eller seerne allerede har erfaring med de generelle prøvepreparerings- og databehandlingsprosedyrene for kryo-EM-eksperimenter og legger vekt på aspektene som er relevante for høy temperatur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

Prøvegitterene for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) eksperimenter fremstilles vanligvis ved en temperatur som er optimal for lagring av biologiske prøver, hovedsakelig ved 4 ° C og noen ganger ved romtemperatur. Nylig oppdaget vi at proteinstrukturen løst ved lav temperatur kanskje ikke er funksjonelt relevant, spesielt for proteiner fra termofil archaea. En prosedyre ble utviklet for å forberede proteinprøver ved høyere temperaturer (opptil 70 ° C) for kryo-EM-analyse. Vi viste at strukturene fra prøver fremstilt ved høyere temperaturer er funksjonelt relevante og temperaturavhengige. Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av prøvegitter ved høy temperatur, med 55 °C som eksempel. Forsøket benyttet et vitrifikasjonsapparat modifisert ved hjelp av et ekstra sentrifugerør, og prøver ble inkubert ved 55 °C. De detaljerte prosedyrene ble finjustert for å minimere dampkondens og oppnå et tynt lag med is på rutenettet. Eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter er gitt.

Oversikten over lav forstørrelse er vist i figur 5A,B. Panel A er et eksempel på et vellykket rutenett. Det er en isgradient fra øverst til venstre (tykkere) til nederst til høyre (tynnere eller tom). Et slikt rutenett gjør det lettere å finne en passende tykkelse på islaget i midtområdet som er egnet for datainnsamling, for eksempel de blå og grønne boksene. Rutenettet B er for tørt. Rutene i rutenettet har lys kontrast, noe som betyr at islaget er for tynt eller...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Dette papiret gir en detaljert protokoll for å forberede prøvegitter ved temperaturer så høye som 70 ° C, før dypping for kryo-EM-eksperimenter.

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Funksjonene til proteiner er temperaturavhengige og er optimale ved temperaturen. Denne protokollen gir en måte å løse proteinstrukturer ved høyere temperaturer. Denne tilnærmingen kan gi funksjonelt relevante strukturer og øke forståelsen av temperaturavhengigheten av proteinstrukturer.Yuan-Chih Chang, leder for Academia Sinica Cryo EM-anlegget vil demonstrere prosedyren. Begynn med å lage et centimeter hull i et 50 millimeter sentrifugerør på den lukkede enden. Plasser røret i vitrifikasjonsapparatkammeret ved ultralyd vannutløpet.Sett opp vitrifikasjonsapparatets temperatur til den angitte temperaturen, og la vitrifikasjonsapparatkammeret nå 55 grader Celsius og 100% relativ fuktighet. La det stå i minst en halv time for å stabilisere forholdene før du starter eksperimentet. Plasser vannbadet på en kokeplate og sett kokeplaten til ønsket temperatur.Sjekk med et termometer for å sikre at vannet når 55 grader Celsius. Inkuber prøven i vannbadet, og forvarm pipettespissen på kanten av kokeplaten i to minutter eller lenger før blottingforsøket. Glød utladning et hullete karbonstøttet rutenett på 25 milliampere i 30 sekunder.Plasser vitrifikasjonsfilterpapiret i vitrifikasjonsapparatkammeret ikke før fem minutter før blottingeksperimentet. Inkuber pinsetten med rutenettet i vitrifikasjonsapparatet i to minutter eller lenger. Bygg etanbeholderen med etan i henhold til standardprosedyrer, slik at etanen ikke renner over.Bruk en pipette til å påføre syv til ni mikroliter av prøven på rutenettet. Vent deretter i ett til to sekunder, flekk i ett til ett og et halvt sekund, og kast prøven raskt ut i flytende etan. Overfør rutenettet fra flytende etan til kryoboksen lagret i flytende nitrogen.Klipp ristene og loss dem for å skaffe elektronmikroskop eller Cryo EM-instrument. Bruk displayet på Cryo EM-instrumentet og lavdosefunksjonen til programvaren til å skjerme istilstanden på rutenettet og fordelingen av prøven på rutenettet. Hvis kvaliteten på det resulterende rutenettet ikke er bra, gjenta prosessen med nettforberedelse med varierte forhold som ventetid, blottingstid, etc.Hvis kvaliteten på det resulterende rutenettet er bra, gjenta de samme trinnene for å lage rister med en annen temperatur. Overfør rutenettene av god kvalitet til et høyoppløselig Cryo EM-instrument. Utføre datainnsamling og dataanalyser i henhold til etablerte prosedyrer.Når det gjelder det vellykkede rutenettet, ble det dannet en isgradient med tykkere is øverst til venstre i rutenettet og tynnere is nederst til høyre. Blå og grønne bokser egnet for datainnsamling ble observert i det vellykkede rutenettet. En lys kontrast ble observert i det andre rutenettet.Indikerer et tynt lag, av is eller fravær av is. Bare to firkanter ble funnet å være egnet for datainnsamling i det andre rutenettet. Et av rutenettene besto av is hovedsakelig i krystallinform, noe som var uegnet for datainnsamling.På den annen side viste det andre rutenettet at islaget for det meste var i en amorf tilstand som var egnet for datainnsamling. Forberedelsen av som en beholder og andre må være fullstendig i henhold til et tidspunkt. Tidskontroll og og etterbehandling av eksperimentet raskt og nøyaktig er viktigst.Avhengig av resultatene oppnådd ved hjelp av denne protokollen, må forskeren kanskje være mer forsiktig med å sette opp de enkle forholdene.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveprepareringsmetode for å skille enkeltlag fra flerlags eller konsentrerte biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Kryo-EM-datainnsamling med enkeltpartikler med scenetilt ved bruk av Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anvendelse av monolags grafen til kryo-elektronmikroskopigitter for høyoppløselig strukturbestemmelse

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...