Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Авторы благодарят доктора Эрве Ремиджи из Thermo Fisher Scientific за полезные советы. Крио-ЭМ-эксперименты проводились в Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM поддерживается Academia Sinica (Грант No. AS-CFII-108-110) и Тайваньский протеиновый проект (грант No. AS-KPQ-109-TPP2). Авторы также благодарят г-жу Хуэй-Цзюй Хуан за помощь в подготовке проб.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол направлен на использование модифицированного коммерческого витрификационного аппарата для подготовки образцов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) при определенных температурах, особенно выше 37 °C. Общая экспериментальная установка показана н...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

На шаге 1 протокола убедитесь, что трубка центрифуги установлена хорошо и не падает во время эксперимента. В связи с накоплением в камере большого количества капель воды, которые могли изменить адсорбционную способность фильтровальной бумаги, рекомендуется, чтобы общее время эксперим?...

Крио-ЭМ-технология решения структур белковых комплексов продолжала совершенствоваться, особенно в направлении получения структур высокого разрешения 1,2. В то же время ландшафт его применения также был расширен за счет изменения условий отбора проб, таких как рН или лиганды, до процесса витрификации3, который включает в себя подготовку сеток образцов с последующим погружным замораживанием 4,5. Еще одним важным условием является температура. Хотя крио-ЭМ-эксперименты, такие как рентгеновская кристаллография, выполняются при низких температурах, структура, решаемая крио-ЭМ, отражает структуру в состоянии раствора до витрификации. До недавнего времени в большинстве крио-ЭМ-исследований анализа одиночных частиц (SPA) использовались образцы, которые хранятся на льду (т.е. при 4 °C) до витрификации6, хотя в ряде исследований используются образцы при комнатной температуре около 7,8,9,10 или до 42 °C 11. В недавнем отчете мы провели температурно-зависимые исследования фермента кетол-кислотной редуктоизомеразы (KARI) из термофильного археона Sulfolobus solfataricus (Sso) при шести различных температурах от 4 ° C до 70 ° C12. Наши исследования показывают, что важно готовить сетки образцов при функционально значимых температурах и что крио-ЭМ является единственным структурным методом, который практически осуществим для решения структуры одного и того же белкового комплекса при нескольких температурах.
Основная трудность для витрификации при высоких температурах заключается в минимизации конденсации пара и достижении тонкого льда. Здесь мы сообщаем о подробном протоколе, используемом для подготовки сеток образцов при высоких температурах в нашем предыдущем исследовании Sso-KARI 12. Мы предполагаем, что читатели или зрители уже имеют опыт в общих процедурах подготовки образцов и обработки данных для крио-ЭМ-экспериментов, и подчеркиваем аспекты, относящиеся к высокой температуре.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

Сетки образцов для экспериментов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) обычно готовят при температуре, оптимальной для хранения биологических образцов, в основном при 4 °C и иногда при комнатной температуре. Недавно мы обнаружили, что структура белка, решенная при низкой температуре, может быть функционально неактуальной, особенно для белков из термофильных архей. Была разработана процедура подготовки образцов белка при более высоких температурах (до 70 °C) для крио-ЭМ-анализа. Мы показали, что структуры из образцов, полученных при более высоких температурах, функционально значимы и зависят от температуры. Здесь мы опишем подробный протокол подготовки пробных сеток при высокой температуре, используя в качестве примера 55 °C. В эксперименте использовали витрификационный аппарат, модифицированный с использованием дополнительной центрифужной трубки, и образцы инкубировали при 55 °C. Подробные процедуры были точно настроены, чтобы свести к минимуму конденсацию пара и получить тонкий слой льда на сетке. Приведены примеры успешных и неудачных экспериментов.

Обзор низкого увеличения показан на рисунке 5A,B. Панель A является примером успешной сетки. Есть градиент льда сверху слева (толще) до нижнего правого (тоньше или пустее). Такая сетка облегчает поиск подходящей толщины ледяного слоя в средней области, подходящей ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

В этой статье представлен подробный протокол подготовки сеток для образцов при температурах до 70 °C перед погружением замораживания для крио-ЭМ-экспериментов.

Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Функции белков зависят от температуры и оптимальны при температуре. Этот протокол обеспечивает способ решения белковых структур при более высоких температурах. Этот подход может обеспечить функционально значимые структуры и улучшить понимание температурной зависимости белковых структур.Демонстрировать процедуру будет Юань-Чи Чанг, менеджер academia Sinica Cryo EM. Начните с того, что сделайте односантиметровое отверстие в 50-миллиметровой центрифужной трубке на ее закрытом конце. Поместите трубку в камеру витрификационного аппарата на выходе ультразвуковой воды.Установите температуру витрификационного аппарата до заданной температуры, и позвольте камере аппарата витрификации достигать 55 градусов Цельсия и 100% относительной влажности. Дайте ему постоять не менее получаса, чтобы стабилизировать условия перед началом эксперимента. Поместите водяную баню на конфорку и установите конфорку на нужную температуру.Проверьте с помощью термометра, чтобы убедиться, что вода достигает 55 градусов по Цельсию. Инкубируйте образец на водяной бане и разогрейте наконечник пипетки на краю конфорки в течение двух минут или дольше перед экспериментом по промоканию. Тлеющий разряд дырявой углеродной сетки при 25 миллиампер в течение 30 секунд.Поместите фильтровальную бумагу для витрификации в камеру витрификационного аппарата не ранее, чем за пять минут до эксперимента по промоканию. Инкубируйте пинцет сеткой в витрификационном аппарате в течение двух минут или дольше. Постройте этановый контейнер с этаном в соответствии со стандартными процедурами, гарантируя, что этан не переполнится.Используйте пипетку, чтобы нанести семь-девять микролитров образца на сетку. Затем подождите одну-две секунды, промокните от одной до полутора секунд и быстро погрузите образец в жидкий этан. Перенесите сетку из жидкого этана в криобокс, хранящийся в жидком азоте.Обрежьте сетки и выгрузите их, чтобы получить электронный микроскоп или прибор Cryo EM. Используйте экран отображения прибора Cryo EM и функцию низкой дозы программного обеспечения для скрининга состояния льда на сетке и распределения образца по сетке. Если качество полученной сетки не очень хорошее, повторите процесс подготовки сетки с различными условиями, такими как время ожидания, время промокания и т. Д.Если качество полученной сетки хорошее, повторите те же шаги, чтобы сделать сетки при другой температуре. Перенесите сетки хорошего качества на прибор Cryo EM высокого разрешения. Осуществлять сбор и анализ данных в соответствии с установленными процедурами.В случае успешной сетки образуется градиент льда с более толстым льдом в левом верхнем углу сетки и более тонким льдом в правом нижнем углу. Синие и зеленые квадраты, пригодные для сбора данных, были замечены в успешной сетке. Яркий контраст наблюдался в другой сетке.Указывает на тонкий слой, льда или отсутствие льда. Было признано, что только два квадрата подходят для сбора данных во второй сетке. Одна из решеток состояла из льда в основном в кристаллиновой форме, что было непригодно для сбора данных.С другой стороны, другая сетка показала, что слой льда был в основном в аморфном состоянии, подходящем для сбора данных. Подготовка в качестве контейнера и других должна быть завершена в соответствии с временным моментом. Контроль времени и быстрое и точное завершение эксперимента являются наиболее важными.В зависимости от результатов, полученных с использованием этого протокола, исследователю, возможно, придется быть более осторожным в настройке простых условий.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Применение монослойного графена в решетках криоэлектронной микроскопии для определения структуры с высоким разрешением

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...