Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Hervé Remigy från Thermo Fisher Scientific för användbara råd. Kryo-EM-experimenten utfördes vid Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM stöds av Academia Sinica (bidrag nr. AS-CFII-108-110) och Taiwan Protein Project (bidrag nr. AS-KPQ-109-TPP2). Författarna tackar också Hui-Ju Huang för hjälpen med provberedningen.

OBS: Detta protokoll syftar till att använda en modifierad kommersiell förglasningsapparat för att förbereda kryoelektronmikroskopiproverna (kryo-EM) vid specifika temperaturer, särskilt högre än 37 °C. Den övergripande experimentella inställningen visas i figur 1. Protokollet använder 55 °C som exempel. För de särskilda förhållandena vid andra temperaturer, se tilläggstabell 2 i referens12.
1. Beredning av förglasningsappa...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

I steg 1 i protokollet, se till att centrifugröret har installerats väl och inte faller när experimentet pågår. På grund av ackumuleringen av ett stort antal vattendroppar i kammaren, vilket kan förändra filterpapperets adsorptionskapacitet, rekommenderas att den totala tiden för experimentet inte får överstiga 30 minuter efter att förglasningsapparatkammaren nådde jämviktstemperaturen. Om driftstiden överstiger 30 minuter måste operatören byta ut filterpapperet och vänta på att kabinen balanserar temp...

Kryo-EM-tekniken för att lösa strukturerna i proteinkomplex har fortsatt att förbättras, särskilt i riktning mot att erhålla högupplösta strukturer 1,2. Under tiden har landskapet för dess tillämpning också utvidgats genom att variera provförhållandena såsom pH eller ligander före förglasningsprocessen3, vilket innebär beredning av provgaller följt av doppfrysning 4,5. Ett annat viktigt villkor är temperaturen. Även om kryo-EM-experiment, som röntgenkristallografi, utförs vid låga temperaturer, återspeglar strukturen som löses av kryo-EM strukturen vid lösningstillståndet före förglasning. Fram till nyligen använder majoriteten av kryo-EM-studier med en partikelanalys (SPA) prover som hålls på is (dvs. vid 4 ° C) före förglasning6, även om ett antal studier använder prover vid cirkarumstemperatur 7,8,9,10 eller så högt som 42 ° C 11. I en ny rapport utförde vi temperaturberoende studier av enzymet ketolsyrareduktoisomeras (KARI) från den termofila arkéen Sulfolobus solfataricus (Sso) vid sex olika temperaturer från 4 °C till 70 °C12. Våra studier tyder på att det är viktigt att förbereda provnät vid funktionellt relevanta temperaturer och att kryo-EM är den enda strukturella metoden som är praktiskt genomförbar för att lösa strukturen hos samma proteinkomplex vid flera temperaturer.
Den stora svårigheten för förglasning vid höga temperaturer är att minimera ångkondens och uppnå tunn is. Här rapporterar vi det detaljerade protokollet som används för att förbereda provnät vid höga temperaturer i vår tidigare studie av Sso-KARI 12. Vi antar att läsarna eller tittarna redan har erfarenhet av de övergripande provberednings- och databehandlingsförfarandena för kryo-EM-experiment och betonar de aspekter som är relevanta för hög temperatur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

Provgallren för kryoelektronmikroskopiexperiment (kryo-EM) framställs vanligtvis vid en temperatur som är optimal för lagring av biologiska prover, mestadels vid 4 °C och ibland vid rumstemperatur. Nyligen upptäckte vi att proteinstrukturen som löses vid låg temperatur kanske inte är funktionellt relevant, särskilt för proteiner från termofila arkéer. Ett förfarande utvecklades för att framställa proteinprover vid högre temperaturer (upp till 70 °C) för kryo-EM-analys. Vi visade att strukturerna från prover framställda vid högre temperaturer är funktionellt relevanta och temperaturberoende. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av provgaller vid hög temperatur, med 55 °C som exempel. I experimentet användes en förglasningsapparat som modifierats med hjälp av ytterligare ett centrifugrör, och proverna inkuberades vid 55 °C. De detaljerade procedurerna finjusterades för att minimera ångkondens och få ett tunt lager is på gallret. Exempel på framgångsrika och misslyckade experiment ges.

Översikten över låg förstoring visas i figur 5A,B. Panel A är ett exempel på ett framgångsrikt rutnät. Det finns en isgradient från övre vänstra (tjockare) till nedre högra (tunnare eller tom). Ett sådant rutnät gör det lättare att hitta en lämplig tjocklek på isskiktet i mittområdet som är lämpligt för datainsamling, såsom de blå och gröna rutorna. Gallret B är för torrt. Rutorna i rutnätet har ljus kontrast, vilket innebär att islagret är för...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Detta dokument ger ett detaljerat protokoll för att förbereda provgaller vid temperaturer så höga som 70 ° C, före doppfrysning för kryo-EM-experiment.

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Proteinernas funktioner är temperaturberoende och är optimala vid temperaturen. Detta protokoll ger ett sätt att lösa proteinstrukturer vid högre temperaturer. Detta tillvägagångssätt kan ge funktionellt relevanta strukturer och öka förståelsen för proteinstrukturernas temperaturberoende.Demonstrerar proceduren kommer att vara Yuan-Chih Chang, chef för Academia Sinica Cryo EM-anläggningen. Börja med att göra ett hål på en centimeter i ett 50 millimeter centrifugrör i dess slutna ände. Placera röret i förglasningsapparatkammaren vid ultraljudsvattenutloppet.Ställ in förglasningsapparatens temperatur till den angivna temperaturen och låt förglasningsapparatens kammare nå 55 grader Celsius och 100% relativ fuktighet. Låt det stå i minst en halvtimme för att stabilisera förhållandena innan experimentet påbörjas. Placera vattenbadet på en kokplatta och ställ in kokplattan till önskad temperatur.Kontrollera med en termometer för att säkerställa att vattnet når 55 grader Celsius. Inkubera provet i vattenbadet och förvärm pipettspetsen på kanten av värmeplattan i två minuter eller längre före blottningsexperimentet. Glöd urladdning ett håligt kolstödt galler vid 25 milliampere i 30 sekunder.Placera förglasningsfilterpapperet i förglasningsapparatens kammare tidigast fem minuter före blottningsexperimentet. Inkubera pincetten med gallret i förglasningsapparaten i två minuter eller längre. Bygg etanbehållaren med etan enligt standardprocedurer, så att etan inte överflödar.Använd en pipett för att applicera sju till nio mikroliter av provet på gallret. Vänta sedan i en till två sekunder, torka i en till en och en halv sekund och kasta snabbt provet i flytande etan. Överför gallret från flytande etan till kryoboxen lagrad i flytande kväve.Klipp gallren och lossa dem för att skaffa elektronmikroskop eller Cryo EM-instrument. Använd skärmen på Cryo EM-instrumentet och programvarans lågdosfunktion för att screena istillståndet på gallret och fördelningen av provet på gallret. Om kvaliteten på det resulterande gallret inte är bra, upprepa processen för nätberedning med olika förhållanden som väntetid, blottningstid, et cetera.Om kvaliteten på det resulterande gallret är bra, upprepa samma steg för att göra galler vid en annan temperatur. Överför gallren av god kvalitet till ett högupplöst Cryo EM-instrument. Utföra datainsamling och dataanalyser enligt fastställda rutiner.När det gäller det framgångsrika rutnätet bildades en isgradient med tjockare is längst upp till vänster på gallret och tunnare is längst ner till höger. Blå och gröna lådor som är lämpliga för datainsamling observerades i det framgångsrika rutnätet. En ljus kontrast observerades i det andra rutnätet.Indikerar ett tunt lager, av is eller frånvaro av is. Endast två rutor befanns vara lämpliga för datainsamling i det andra rutnätet. Ett av rutnäten bestod av is mestadels i kristallinform, vilket var olämpligt för datainsamling.Å andra sidan visade det andra rutnätet att islagret mestadels var i ett amorft tillstånd som var lämpligt för datainsamling. Förberedelsen av som en behållare och andra måste vara komplett enligt en tidpunkt. Tidskontroll och och avsluta experimentet snabbt och exakt är viktigast.Beroende på de resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll kan forskaren behöva vara mer försiktig med att ställa in de enkla förhållandena.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-tekniken: en kryo-EM-provberedningsmetod för att separera enstaka lager från flerskiktiga eller koncentrerade biologiska prover

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM-datainsamling med steglutning med Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Tillämpning av monolagergrafen på kryoelektronmikroskopinät för högupplöst strukturbestämning

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...