Name: preparation of high-temperature sample grids for cryo-em
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Yazarlar, yararlı tavsiyeler için Thermo Fisher Scientific'ten Dr. Hervé Remigy'ye teşekkür eder. Kriyo-EM deneyleri Academia Sinica Cryo-EM Tesisi'nde (ASCEM) gerçekleştirildi. ASCEM, Academia Sinica (Hibe No. AS-CFII-108-110) ve Tayvan Protein Projesi (Hibe No. AS-KPQ-109-TPP2). Yazarlar ayrıca numune hazırlama konusundaki yardımları için Bayan Hui-Ju Huang'a teşekkür eder.

NOT: Bu protokol, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) örneklerini belirli sıcaklıklarda, özellikle 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda hazırlamak için modifiye edilmiş bir ticari vitrifikasyon aparatı kullanmayı amaçlamaktadır. Genel deney düzeni Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol örnek olarak 55 ° C kullanır. Diğer sıcaklıklardaki özel koşullar için lütfen referans12'deki Ek Tablo 2'ye bakın.
1. Vitrifikasyo...

<ol>
	<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li><li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution.">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li><li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase.">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li><li>Cabra, V., Sams&#243;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+of+cryo-electron+microscopy:+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction.">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis.">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+operating+principles+of+the+replisome.">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li><li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM.">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy.">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li><li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3.">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li><li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions.">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li></ol>

Protokolün 1. adımında, santrifüj tüpünün iyi monte edildiğinden ve deney devam ederken düşmediğinden emin olun. Haznede, filtre kağıdının adsorpsiyon kapasitesini değiştirebilecek çok sayıda su damlacığının birikmesi nedeniyle, vitrifikasyon aparatı haznesi denge sıcaklığına ulaştıktan sonra deneyin toplam süresinin 30 dakikayı geçmemesi önerilir. Çalışma süresi 30 dakikayı aşarsa, operatörün filtre kağıdını değiştirmesi ve kabinin sıcaklık ve nemi tekrar dengelemesini b...

Protein komplekslerinin yapılarını çözmek için kriyo-EM teknolojisi, özellikle yüksek çözünürlüklü yapıların elde edilmesi yönünde gelişmeye devam etmiştir 1,2. Bu arada, vitrifikasyon prosesinden önce pH veya ligandlar gibi numune koşullarının değiştirilmesiyle uygulama alanı da genişletilmiştir3, bu da numune ızgaralarının hazırlanmasını ve ardından dalma dondurma 4,5'i içerir. Bir diğer önemli koşul sıcaklıktır. X-ışını kristalografisi gibi kriyo-EM deneyleri düşük sıcaklıklarda yapılmasına rağmen, kriyo-EM ile çözülen yapı, vitrifikasyondan önceki çözelti durumundaki yapıyı yansıtır. Yakın zamana kadar, tek parçacık analizi (SPA) kriyo-EM çalışmalarının çoğu, vitrifikasyon6'dan önce buz üzerinde (yani 4 ° C'de) tutulan örnekleri kullanır, ancak bir dizi çalışma oda sıcaklığında 7,8,9,10 veya 42 ° C 11 kadar yüksek numuneler kullanır. Yakın tarihli bir raporda, termofilik arkeon Sulfolobus solfataricus'tan (Sso) ketol-asit redüktoizomeraz (KARI) enziminin sıcaklığa bağlı çalışmalarını 4 ° C ila 70 ° C12 arasında altı farklı sıcaklıkta gerçekleştirdik. Çalışmalarımız, fonksiyonel olarak ilgili sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamanın önemli olduğunu ve kriyo-EM'nin aynı protein kompleksinin yapısını çoklu sıcaklıklarda çözmek için pratik olarak mümkün olan tek yapısal yöntem olduğunu göstermektedir.
Yüksek sıcaklıklarda vitrifikasyon için en büyük zorluk, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ince buz elde etmektir. Burada, Sso-KARI 12 ile ilgili önceki çalışmamızda yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için kullanılan ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Okuyucuların veya izleyicilerin kriyo-EM deneyleri için genel numune hazırlama ve veri işleme prosedürlerinde zaten deneyimli olduklarını varsayıyoruz ve yüksek sıcaklıkla ilgili yönleri vurguluyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>size: 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>&#216;55/20mm, Grade 595</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI1210</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K100X</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>glow discharge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>658-200-CU-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1063996</td>
			<td>low dose imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1086439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Tweezer</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>47000-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of high-temperature sample grids for cryo-em

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) deneyleri için numune ızgaraları genellikle biyolojik numunelerin depolanması için en uygun sıcaklıkta, çoğunlukla 4 ° C'de ve bazen oda sıcaklığında hazırlanır. Son zamanlarda, düşük sıcaklıkta çözülen protein yapısının, özellikle termofilik arkelerden gelen proteinler için işlevsel olarak alakalı olmayabileceğini keşfettik. Kriyo-EM analizi için daha yüksek sıcaklıklarda (70 ° C'ye kadar) protein örnekleri hazırlamak için bir prosedür geliştirilmiştir. Daha yüksek sıcaklıklarda hazırlanan numunelerden elde edilen yapıların işlevsel olarak alakalı ve sıcaklığa bağlı olduğunu gösterdik. Burada, örnek olarak 55 °C kullanarak numune ızgaralarını yüksek sıcaklıkta hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Deney, ek bir santrifüj tüpü kullanılarak modifiye edilmiş bir vitrifikasyon aparatı kullandı ve numuneler 55 ° C'de inkübe edildi. Ayrıntılı prosedürler, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ızgarada ince bir buz tabakası elde etmek için ince ayarlandı. Başarılı ve başarısız deneylere örnekler verilmiştir.

Düşük büyütmeye genel bakış Şekil 5A,B'de gösterilmiştir. Panel A, başarılı bir ızgara örneğidir. Sol üstten (daha kalın) sağ alta (daha ince veya boş) bir buz gradyanı vardır. Böyle bir ızgara, mavi ve yeşil kutular gibi veri toplama için uygun orta alanda uygun bir buz tabakası kalınlığı bulmayı kolaylaştırır. B ızgarası çok kuru. Izgaradaki kareler parlak kontrasta sahiptir, bu da buz tabakasının çok ince olduğu veya hiç buz taba...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM at JoVE.com

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Bu makale, kriyo-EM deneyleri için donma işlemine dalmadan önce, 70 ° C'ye kadar yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Proteinlerin fonksiyonları sıcaklığa bağlıdır ve sıcaklıkta optimaldir. Bu protokol, protein yapılarını daha yüksek sıcaklıklarda çözmenin bir yolunu sağlar. Bu yaklaşım, işlevsel olarak ilgili yapıları sağlayabilir ve protein yapılarının sıcaklığa bağımlılığının anlaşılmasını artırabilir.Prosedürü gösteren, Academia Sinica Cryo EM tesisinin Müdürü Yuan-Chih Chang olacak. Kapalı ucundaki 50 milimetrelik bir santrifüj tüpünde bir santimetrelik bir delik açarak başlayın. Tüpü ultrasonik su çıkışındaki vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin.Vitrifikasyon aparatı sıcaklığını belirtilen sıcaklığa ayarlayın ve vitrifikasyon aparatı odasının 55 santigrat dereceye ve% 100 bağıl neme ulaşmasına izin verin. Deneye başlamadan önce koşulları stabilize etmek için en az yarım saat bekletin. Su banyosunu bir sıcak plakaya yerleştirin ve sıcak plakayı istenen sıcaklığa ayarlayın.Suyun 55 santigrat dereceye ulaştığından emin olmak için bir termometre ile kontrol edin. Numuneyi su banyosunda inkübe edin ve kurutma deneyinden önce sıcak plakanın kenarındaki pipet ucunu iki dakika veya daha uzun süre önceden ısıtın. Işıltı, 25 miliamperde delikli karbon destekli bir ızgarayı 30 saniye boyunca boşaltır.Vitrifikasyon filtre kağıdını, lekeleme deneyinden en geç beş dakika önce vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin. Cımbızları vitrifikasyon aparatındaki ızgara ile iki dakika veya daha uzun süre inkübe edin. Etan kabını standart prosedürlere göre etan ile inşa edin ve etanın taşmamasını sağlayın.Numunenin yedi ila dokuz mikrolitresini ızgaraya uygulamak için bir pipet kullanın. Ardından bir ila iki saniye bekleyin, bir ila bir buçuk saniye lekeleyin ve numuneyi hızlı bir şekilde sıvı etan'a batırın. Izgarayı sıvı etandan sıvı azotta depolanan kriyo kutusuna aktarın.Elektron mikroskobu veya Cryo EM cihazı elde etmek için ızgaraları kırpın ve boşaltın. Cryo EM cihazının ekran ekranını ve yazılımın düşük doz fonksiyonunu kullanarak ızgaradaki buz durumunu ve numunenin ızgaradaki dağılımını görüntüleyin. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyi değilse, ızgara hazırlama işlemini bekleme süresi, lekelenme süresi vb. gibi çeşitli koşullarla tekrarlayın.Elde edilen ızgaranın kalitesi iyiyse, ızgaraları farklı bir sıcaklıkta yapmak için aynı adımları tekrarlayın. Kaliteli ızgaraları yüksek çözünürlüklü bir Cryo EM cihazına aktarın. Belirlenen prosedürlere göre veri toplama ve veri analizleri gerçekleştirin.Başarılı ızgara durumunda, ızgaranın sol üst köşesinde daha kalın buz ve sağ altta daha ince buz ile bir buz gradyanı oluşur. Başarılı ızgarada veri toplamaya uygun mavi ve yeşil kutular gözlenmiştir. Diğer ızgarada parlak bir kontrast gözlendi.İnce bir tabakayı, buz tabakasını veya buz yokluğunu gösterir. İkinci ızgarada veri toplama için sadece iki karenin uygun olduğu bulunmuştur. Izgaralardan biri, çoğunlukla veri toplama için uygun olmayan kristalin formundaki buzdan oluşuyordu.Öte yandan, diğer ızgara buz tabakasının çoğunlukla veri toplama için uygun amorf bir durumda olduğunu gösterdi. Bir kap olarak hazırlanması ve diğerlerinin bir zaman noktasına göre tamamlanması gerekir. Zaman kontrolü ve deneyin hızlı ve doğru bir şekilde bitirilmesi en önemlisidir.Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçlara bağlı olarak, araştırmacının basit koşulları oluştururken daha dikkatli olması gerekebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...