Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل جزئيا مشروع "بنية تحتية للبحوث اليونانية لتصور ورصد العمليات البيولوجية الأساسية (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) الذي ينفذ في إطار عمل "تعزيز البنية التحتية للبحوث والابتكار"، بتمويل من البرنامج التشغيلي "القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار" (NSRF 2014-2020) والذي تشارك في تمويله اليونان والاتحاد الأوروبي.

1. إعداد إنكولوم
ملاحظة: يجب تنفيذ كافة الخطوات ضمن خزانة تدفق صفح.
<ol><li>الشرائط من سلالة الفطرية من الاهتمام، من مخزون الجلسرين (-80 درجة مئوية) باستخدام حلقة تلقيح معقمة، على لوحات من الحد الأدنى من الوسائط (MM) تكملها المتطلبات الغذائية المناسبة ذات الصلة بالسلالة التي تم فح...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus,+Fusarium+and+Mucor.">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li><li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Pathogenic+Fungi:+Genomics,+Molecular+Interactions,+and+Genetic+Improvements.">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li><li>Etxebeste, O., Espeso, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans+in+the+post-genomic+era:+a+top-model+filamentous+fungus+for+the+study+of+signaling+and+homeostasis+mechanisms.">Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms.</a> International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).</li><li>Riquelme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Morphogenesis,+from+the+Polarized+Growth+of+Hyphae+to+Complex+Reproduction+and+Infection+Structures.">Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).</li><li>Athanasopoulos, A., Andr&#233;, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+plasma+membrane+domains.">Fungal plasma membrane domains.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2019).</li><li>Pantazopoulou, A., Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Dynamics+of+the+Aspergillus+nidulans+Golgi+during+Apical+Extension+and+Mitosis.">Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).</li><li>Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+global+gene+expression+and+secondary+metabolite+accumulation+during+light-dependent+Aspergillus+nidulans+development.">Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development.</a> Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).</li><li>Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Development+in+Aspergillus+nidulans+and+Aspergillus+fumigatus.">Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus.</a> Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).</li><li>Tomkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth:+The+petri+dish+method.">Measuring growth: The petri dish method.</a> Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).</li><li>Gifford, D. R., Schoustra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+colony+population+growth+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).</li><li>Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+live+cell+behaviour:+Traditional+label-free+and+quantitative+phase+imaging+approaches.">Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 89-95 (2017).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+microscopy+for+non-invasive+live+cell+population+monitoring.">Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring.</a> Scientific Reports. 11, (2021).</li><li>Chessel, A., Carazo Salas, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+observing+to+predicting+single-cell+structure+and+function+with+high-throughput/high-content+microscopy.">From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy.</a> Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).</li><li>Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Aspergillus+nidulans:+meiotic+progeny+for+genetic+analysis+and+strain+construction.">Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction.</a> Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).</li><li>Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi+Using+Vital+Fluorescent+Dyes+and+Confocal+Microscopy.">Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy.</a> Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).</li><li>Trinci, A. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinetic+Study+of+the+Growth+of+Aspergillus+nidulans+and+Other+Fungi.">A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi.</a> Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).</li><li>Lichius, A., Zeilinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Membrane+and+Cell+Wall+Selective+Fluorescent+Dyes+for+Live-Cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi.">Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).</li><li>Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immersion+oil+for+high-resolution+live-cell+imaging+at+37&#176;C:+optical+and+physical+characteristics.">Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37&#176;C: optical and physical characteristics.</a> Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+of+Zebrafish+Embryonic+Development.">In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development.</a> CSH protocols. 2007, (2007).</li><li>Walzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+low-cost+long-term+live-cell+imaging+platform+for+biomedical+research+and+education.">A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education.</a> Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64.">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li><li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy:+CellStar+and+the+Evaluation+Platform.">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).</li><li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

مراقبة نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو نهج قوي لتقييم السلوك الخلوي في الوقت الحقيقي وكميا ودقيقا تحديد ما إذا كان علاج المخدرات معينة و / أو التدخل الجيني يؤدي إلى نمو الخلايا التي يمكن الكشف عنها أو الاختلافات الظاهري مع مرور الوقت.
في ه?...

الفطريات الخيطية ذات أهمية اجتماعية واقتصادية وإيكولوجية كبيرة ، كونها حاسمة كأدوات صناعية / زراعية لإنتاج الإنزيمات والمضادات الحيوية1،2 وكعوامل ممرضة لنباتات المحاصيل3، حشرات الآفات4 والبشر3. وعلاوة على ذلك، تستخدم الفطريات الخيطية مثل النيدولان أسبيرغيلوس على نطاق واسع ككائنات نموذجية للبحوث الأساسية، مثل الدراسات في علم الوراثة والخلايا والبيولوجيا التطورية وكذلك لدراسة تمديد الواصلة5. الفطريات الخيطية هي كائنات شديدة الاستقطاب التي استطالة من خلال العرض المستمر من الدهون الغشائية / البروتينات وتوليف دي نوفو من جدار الخلية في طرف تمديد6. دور مركزي في نمو طرف الواصلة وصيانة القطبية هو هيكل متخصص يسمى 'Spitzenkorper' (SPK) ، وهو هيكل مرتبة للغاية تتكون في معظمها من مكونات الهيكل الخلوي والتوزيع المستقطب من غولجي6،7،8.
المحفزات البيئية / الإشارات، مثل هذه الواجهة المياه والهواء، والضوء،تركيز ثاني أكسيد الكربون، والحالة الغذائية هي المسؤولة عن القرارات التنموية التي اتخذتها هذه القوالب9. في الثقافات المغمورة (السائل) يتم قمع تمايز النيدولان A. ويحدث النمو عن طريق استطالة طرف الواصلة6. خلال النمو النباتي ، تنبت الجراثيم اللاجنسية (كونيديا) عن طريق التمديد apical ، وتشكيل شبكة غير متمايزة من الخلايا الواصلة المترابطة ، والميسيليوم ، والتي قد تستمر في النمو إلى أجل غير مسمى طالما تتوفر العناصر الغذائية والفضاء. من ناحية أخرى ، على نصائح الواصلة وسائل الإعلام الصلبة استطالة وبعد فترة محددة من النمو النباتي (الكفاءة التنموية) ، ويبدأ التكاثر اللاجنسي وسيقان conidiophore الجوية تمتد من خلايا القدم المتخصصة من الميسيليوم6. هذه تؤدي إلى هياكل متعددة الخلايا التنموية المتخصصة تسمى conidiophores، والتي تنتج سلاسل طويلة من haploid كونيديا10 التي يمكن أن تستأنف النمو في ظل ظروف بيئية مواتية.
وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لقياس النمو الفطري الخيطي هو تطعيم الجراثيم على أجار المغذيات الواردة في طبق بيتري وقياس قطر المستعمرة بالمنظار بعد بضعة أيام11. القطر / منطقة المستعمرة ، والأكثر اعتمادا على التغيرات في معدل النمو mycelial وأقل على كثافة conidiophore12، ثم يستخدم كقيمة للنمو. على الرغم من أن قياس حجم السكان الفطرية (مستعمرة) تنمو على الأسطح الصلبة كافية جدا، فإنه ليس بأي حال من الأحوال مقياس الأكثر دقة للنمو. بالمقارنة مع متوسطات مستوى السكان (متوسطات حجم المستعمرة الفطرية) ، يمكن أن تلتقط قياسات الخلية الواحدة عدم التجانس في مجموعة الخلايا وتسمح بتحديد المجموعات الفرعية الجديدة من الخلايا ، والدول13، والديناميات ، والمسارات ، وكذلك الآليات البيولوجية التي تستجيب بها الخلايا للتغيرات الذاتية والبيئية14،15. يمكن القول إن رصد نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو النهج الكمي الأكثر استخداما لمراقبة الخلايا المفردة.
هنا، نقوم بتفصيل بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسميات باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة (مثل تباين المرحلة، وتباين التداخل التفاضلي (DIC)، والتنظير المجهري المستقطب) لالتقاط الصور، والتي يمكن استخدامها بشكل مستقل عن الاستخدام المشترك للتنظير المجهري الفلوري لتحليل وقياس النمو القطبي لسلالات النيدولان A. في كل من الثقافات المغمورة والوسائط الصلبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

ومن الثابت أن نمو مستعمرة من الفطريات الخيطية، تعتمد في الغالب على التغيرات في معدل النمو apical hyphae / mycelia، ويقدر بشكل كلي على وسائل الإعلام الصلبة من خلال مقارنة حجم المستعمرة. ومع ذلك ، لقياس كمي معدل نمو سلالات الفطريات المختلفة وراثيا أو سلالات في ظل ظروف بيئية / النمو المختلفة (درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، ومصادر الكربون والنيتروجين ، والمضادات الحيوية ، وما إلى ذلك) أمر صعب. وهكذا، فإن السعي إلى اتباع نهج تكميلية لقياس حركة النمو يصبح إلزاميا من أجل فهم أفضل لنمو الخلايا الفطرية. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف جيدا أن الفطريات الخيطية، بما في ذلك أسبيرغيلوس SPP.، لديها أنماط متميزة من النمو والتمايز في ظل ظروف شبه جوية على وسائل الإعلام الصلبة أو الثقافات المغمورة. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة مجهرية كمية لتحليل الحركية النمو من الفطريات نموذج Aspergillus nidulans، وذلك باستخدام التصوير الحي في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. نحن نلتقط الصور ونحلل ونتحديد معدلات نمو السلالات الفطرية المختلفة بطريقة قابلة للاستنساخ وموثوقة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر ومجانية للصور الحيوية (مثل فيجي) ، بطريقة لا تتطلب أي خبرة سابقة في تحليل الصور من المستخدم.

بعد هذا البروتوكول ، التقطنا وحللنا صورا مختلفة تتوافق مع مراحل النمو / النمو المختلفة للفطريات الخيطية A. nidulans. وقد تم تجهيز وتحليل البيانات المقدمة في هذه الدراسة باستخدام برنامج فيجي. تم حفظ القياسات كملفات csv ، وتحليلها إحصائيا وإعدادها كرسم بياني باستخدام البرامج الإحصائية التجا...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

نحن نقدم بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسمية باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة لالتقاط الصور وتحليل وقياس حركة النمو للفطريات الخيطية A. nidulans في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. يمكن استخدام هذا البروتوكول بالتزامن مع المجهر الفلوري.

التحليل الكمي لمعدل نمو النيدولانات Aspergillus باستخدام المجهر الحي والبرمجيات مفتوحة المصدر

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

في هذا الفيديو، ونحن نصف التسمية الحرة بروتوكول التصوير الحي لالتقاط صور للفطريات نموذج aspergillus nidulans، وذلك باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المنقولة. نحن نستخدم هذه الصور لتحليل وقياس حركة نمو النيدولانات أسبيريلوس في كل من الوسائط السائلة والصلبة. يسمح التمثيل المرئي لهذا البروتوكول للمستخدمين بالتعرف على الخطوات الهامة لالتقاط الصور ومعالجة الصور المجهرية.وهناك طريقة شائعة تستخدم لقياس النمو الفطري الخيطي هو اثنين من الجراثيم الفطرية تلقيح في طبق بيتري التي تحتوي على أجار المغذيات وقياس قطر المستعمرة النامية بعد بضعة أيام. ومع ذلك، فإن هذا النهج ليس حساسا بما يكفي لتحديد فروق النمو الدقيقة. لذلك، تم تطوير قياسات خلية واحدة باستخدام المجهر الفاصل الزمني.هذه القياسات قادرة ليس فقط على تقديم نتائج دقيقة وكمية، ولكن أيضا لتعكس ديناميات النمو من الخلايا المختلفة داخل السكان. وعلاوة على ذلك، يهدف هذا النهج إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية المشاركة في استجابات النمو الفطرية للإشارات الذاتية والبيئية. تبدأ بصب 15 ملليلتر من أغار المغذيات السائلة في أطباق بيتري.ضع الغطاء على القمة واتركه يبرد. استخدام الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم لوحات. قبل streaking من سلالة الفطرية من الفائدة من الأسهم، تسخين حلقة الإيماءات في الموقد بونسن حتى يكون أحمر ساخن، تبريد الحلقة عن طريق طعنه في أجار.دوامة الأنبوب وشرائط حلقة عبر سطح المتوسطة أجار الحد الأدنى تكملها مع الاحتياجات الغذائية المناسبة. احتضان لوحات لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية. باستخدام مسواك معقمة، نقل عدد قليل من كونيديا عن طريق لمس بلطف مستعمرة واحدة إلى لوحات من وسائل الإعلام الكاملة.احتضان لوحات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 37 درجة مئوية. يتم حصاد كونيديا من نيدولانس أسبيريلوس، في أنبوب دوامة معقم 1.5 ملليلتر، مع 1.0 ملليلتر من المياه المقطرة الأوتوكلاف التي تحتوي على 0.05٪ حجم لكل حجم، توين 80، للحد من عدد كتل كونيديا. يتم استخدام نسخة معدلة من طريقة أجار مقلوب لتصوير الفطريات الخيطية على سطح متوسط أجار.بقعة في البداية 10 aliquots ميكرولتر من تعليق دوامة بقوة، ما يقرب من مرتين 104 خلايا لكل ملليلتر على أطباق بيتري من 15 ملليلتر الحد الأدنى المتوسط مع وزن واحد لكل حجم أجار. احتضان الثقافة التجريبية وفقا لمرحلة النمو التي سيتم التحقيق فيها. هنا نحتضن لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية.بعد ذلك، شريحة من كتلة من أجار تحتوي على مستعمرة، وذلك باستخدام مشرط معقمة. هنا قطعنا إسفين من أجار على هامش المستعمرة، عكس ووضع شريحة أجار في ثمانية، شريحة جيدا. نقل 10 ميكرولتر aliquots من تعليق دوامة بقوة مرتبة من حوالي مرتين 10 في السلطة من أربعة في آبار شريحة بئر تحتوي على 200 ميكرولتر من الحد الأدنى المتوسط مع المكملات الغذائية المناسبة.احتضان الوقت ودرجة الحرارة ليتم فحصها في كل مرة. اختيار المجهر يعتمد على المعدات المتاحة. على أي حال، يجب أن يتضمن إعداد المجهر مرحلة مقلوبة أو غرفة بيئية أو على الأقل غرفة مع تحكم دقيق في درجة حرارة الهواء.سخني في البداية الحرارة وغرفة المجهر لتثبيت درجة الحرارة المطلوبة. هنا وضعنا درجة الحرارة في 30 درجة مئوية. قم بتشغيل المجهر وطاقة الماسح الضوئي وطاقة الليزر والكمبيوتر، ثم قم بتحميل برنامج التصوير.ضع الشريحة المعدة مسبقا بشكل جيد في مرحلة المجهر والتركيز. ابحث عن مجالات رؤية تحتوي على خلايا معزولة، وليس متداخلة، أو على الأقل غير مكتظة، لتسهيل قياسات النمو أثناء تحليل الصورة. حدد تقنية المجهر الضوئي المرسلة لاستخدامها وتنشيط كاشف الضوء المرسل وكذلك أجهزة الكشف عن الفلورسينس عند الضرورة.تعيين المجهر للحصول على الصور في الفواصل الزمنية المطلوبة وبدء اكتساب سلسلة زمنية. ويتم تحميل وتصور ومعالجة الصور مع البرمجيات مفتوحة المصدر imageJ فيجي. تبدأ باستيراد الصور إلى فيجي باستخدام الإضافات بتنسيق.حدد وضع اللون الافتراضي ومقياس تلقائي. من أجل تصور الطابع الزمني وشريط مقياس كما تراكب تذهب إلى تحليل والأدوات وشريط المقياس. تعيين المعلمات المطلوبة المتعلقة بعرض شريط المقياس وارتفاعه ولونه وموقعه.انتقل إلى الصورة، خصائص، لعرض خصائص الصورة في برنامج imageJ فيجي. مراقبة معلومات الفاصل الزمني للإطار. هنا نستخدم فاصل زمني من حوالي 15 دقيقة واضغط على ما يرام.ثم انتقل إلى الصورة، والمداخن، والتسمية، وتعيين المعلومات الصحيحة للفاصل الزمني. تعيين موقع التسمية عن طريق تعديل X و Y.Set وحدة القياس في نص الحقل ثم اضغط المعاينة. استخدام مطابقة الرسم البياني لتصحيح الإضاءة بين إطارات مختلفة عن طريق اختيار الصورة، وضبط، وتصحيح التبييض، مطابقة الرسم البياني.تظهر نافذة جديدة مع إضاءة مصححة. استخدام البرنامج المساعد MtrackJ في الإضافات، MtrackJ، لتتبع تزايد تلميح واصلة لإضافة المسار، حدد زر إضافة في شريط الأدوات ووضع النقطة الأولى في طرف الواصلة باستخدام النقرة اليسرى من الماوس. سيتم نقل السلسلة الزمنية تلقائيا إلى الإطار التالي.لإكمال عملية التتبع، انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس على النقطة الأخيرة، أو اضغط على مفتاح الهروب. التمرير جدول الإخراج، العمود الأكثر أهمية لحساب نمو تلميح الواصلة، هو السرعة في أي إطار معين. قياسات المسار الآمن، إضافة ملف، حفظ كما، إلى تنسيق الملف من اختيارك، على سبيل المثال، CSV، استيراد الملف المحفوظة في برنامج جدول البيانات وحساب التصور واختبارات أخرى.اضغط على زر الفيلم لتوليد فيلم، RGB نوع اللون، التي تحتوي على إطارات مع المسارات رسمها في نفوسهم، والتي يمكن تصورها في أي مشغل الوسائط المتعددة القياسية. بعد هذا البروتوكول، التقطنا وحللنا صورا مختلفة تتوافق مع مراحل النمو والتطوير المختلفة للفطريات الخيطية aspergillus nidulans. ويبين الشكل مقارنة النوع البري وقياسات معدل نمو دلتا نهر الدلتا azhAD Delta.دلتا azhAD دلتا ngnA هو سلالة مزدوجة المحذوفة في اثنين من الجينات المتورطة في إزالة السموم واستيعاب المنتج مقاتلة سامة L كما أضيفت في اثنين من حمض الكاروبوكسيليك. وهو يبين قياسات معدل نمو أقل دلالة إحصائيا مقارنة بسلالة النوع البري في الثقافات السائلة المغمورة بالمياه. هذا الاختلاف في النمو غير قابل للكشف عن طريق قياس منطقة مستعمرة من هاتين السلالات في المتوسط الحد الأدنى الصلبة.خلية واحدة، والتصوير الحي على المدى الطويل هو ذات قيمة كبيرة في الجهود المبذولة للحصول على معلومات سباسي وزمنية من ديناميات البروتينات الخلوية. هذا البروتوكول مناسب أيضا لإجراء تصوير الخلايا الحية على المدى الطويل. هنا نرى إنبات كونيديا المشاركة في التعبير عن GFP المسمى البروتين eisosomal الأساسية بيلا و MRFP histonen H1. هنا في نقدم بروتوكولا لتحليل الحركية نمو الفطرية بطريقة استنساخها وموثوق بها دون الحاجة إلى أي تجربة تحليل الصور السابقة من المستخدم.يسمح هذا البروتوكول بالتحديد الكمي الدقيق الموضوعي للنمو الفطري.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

تتبع وقياس العمليات التنموية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أدوات المصدر المفتوح

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...