Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het project "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) dat wordt uitgevoerd in het kader van de actie "Versterking van de onderzoeks- en innovatie-infrastructuur", gefinancierd door het operationele programma "Concurrentievermogen, ondernemerschap en innovatie" (NSRF 2014-2020) en medegefinancierd door Griekenland en de EU.

1. Entbereiding
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een laminaire flowkast.
<ol><li>Streep de interessante schimmelstam uit, van een glycerolvoorraad (-80 °C) met behulp van een steriele inentingslus, op platen van minimale media (MM) aangevuld met de juiste voedingsbehoeften die relevant zijn voor de onderzochte stam [MM: 10,0 g/L glucose, 20 ml/l zoutoplossing (zoutoplossing: 26 g/l KCl, 26 g/l MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus,+Fusarium+and+Mucor.">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li><li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Pathogenic+Fungi:+Genomics,+Molecular+Interactions,+and+Genetic+Improvements.">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li><li>Etxebeste, O., Espeso, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans+in+the+post-genomic+era:+a+top-model+filamentous+fungus+for+the+study+of+signaling+and+homeostasis+mechanisms.">Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms.</a> International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).</li><li>Riquelme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Morphogenesis,+from+the+Polarized+Growth+of+Hyphae+to+Complex+Reproduction+and+Infection+Structures.">Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).</li><li>Athanasopoulos, A., Andr&#233;, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+plasma+membrane+domains.">Fungal plasma membrane domains.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2019).</li><li>Pantazopoulou, A., Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Dynamics+of+the+Aspergillus+nidulans+Golgi+during+Apical+Extension+and+Mitosis.">Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).</li><li>Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+global+gene+expression+and+secondary+metabolite+accumulation+during+light-dependent+Aspergillus+nidulans+development.">Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development.</a> Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).</li><li>Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Development+in+Aspergillus+nidulans+and+Aspergillus+fumigatus.">Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus.</a> Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).</li><li>Tomkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth:+The+petri+dish+method.">Measuring growth: The petri dish method.</a> Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).</li><li>Gifford, D. R., Schoustra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+colony+population+growth+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).</li><li>Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+live+cell+behaviour:+Traditional+label-free+and+quantitative+phase+imaging+approaches.">Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 89-95 (2017).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+microscopy+for+non-invasive+live+cell+population+monitoring.">Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring.</a> Scientific Reports. 11, (2021).</li><li>Chessel, A., Carazo Salas, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+observing+to+predicting+single-cell+structure+and+function+with+high-throughput/high-content+microscopy.">From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy.</a> Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).</li><li>Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Aspergillus+nidulans:+meiotic+progeny+for+genetic+analysis+and+strain+construction.">Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction.</a> Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).</li><li>Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi+Using+Vital+Fluorescent+Dyes+and+Confocal+Microscopy.">Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy.</a> Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).</li><li>Trinci, A. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinetic+Study+of+the+Growth+of+Aspergillus+nidulans+and+Other+Fungi.">A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi.</a> Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).</li><li>Lichius, A., Zeilinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Membrane+and+Cell+Wall+Selective+Fluorescent+Dyes+for+Live-Cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi.">Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).</li><li>Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immersion+oil+for+high-resolution+live-cell+imaging+at+37&#176;C:+optical+and+physical+characteristics.">Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37&#176;C: optical and physical characteristics.</a> Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+of+Zebrafish+Embryonic+Development.">In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development.</a> CSH protocols. 2007, (2007).</li><li>Walzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+low-cost+long-term+live-cell+imaging+platform+for+biomedical+research+and+education.">A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education.</a> Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64.">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li><li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy:+CellStar+and+the+Evaluation+Platform.">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).</li><li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

Het monitoren van schimmelcelgroei en fenotype door time-lapse microscopie is een krachtige benadering om cellulair gedrag in realtime en kwantitatief en nauwkeurig te beoordelen of een bepaalde medicamenteuze behandeling en / of genetische interventie resulteert in detecteerbare celgroei of fenotypische verschillen in de loop van de tijd.
In deze studie werd een betrouwbare live-cell imaging methodologie beschreven om de ontwikkeling van schimmels te meten en kwantitatief te analyseren, inclu...

Filamenteuze schimmels zijn van groot sociaaleconomisch en ecologisch belang, omdat ze zowel cruciaal zijn als industriële / agrarische hulpmiddelen voor enzym- en antibioticaproductie1,2 en als pathogenen van gewasplanten3, plaaginsecten4 en mensen3. Bovendien worden filamenteuze schimmels zoals Aspergillus nidulans veel gebruikt als modelorganismen voor fundamenteel onderzoek, zoals studies in genetica, cel- en evolutionaire biologie en voor de studie van hyphal-extensie5. Filamenteuze schimmels zijn sterk gepolariseerde organismen die zich uitstrekken door de continue toevoer van membraanlipiden / eiwitten en de de novo synthese van celwand aan de uitstrekkende punt6. Een centrale rol in de groei en het behoud van de hyphalte tip is een gespecialiseerde structuur genaamd 'Spitzenkorper' (SPK), een zeer geordende structuur die voornamelijk bestaat uit cytoskeletcomponenten en de gepolariseerde verdeling van de Golgi6,7,8.
Omgevingsstimuli/signalen, zoals water-lucht interface, licht, CO2-concentratie en de voedingstoestand zijn verantwoordelijk voor de ontwikkelingsbeslissingen die door deze mallen worden genomen9. In ondergedompelde (vloeibare) culturen wordt de differentiatie van A. nidulans onderdrukt en vindt groei plaats door hyphal tip elongatie6. Tijdens vegetatieve groei ontkiemen aseksuele sporen (conidia) door apicale extensie en vormen ze een ongedifferentieerd netwerk van onderling verbonden hyphalcellen, het mycelium, dat onbeperkt kan blijven groeien zolang voedingsstoffen en ruimte beschikbaar zijn. Aan de andere kant, op solide media hyphal tips verlengen en na een gedefinieerde periode van vegetatieve groei (ontwikkelingscompetentie), wordt aseksuele reproductie geïnitieerd en breiden conidiofore stengels vanuit de lucht zich uit van gespecialiseerde voetcellen van het mycelium6. Deze geven aanleiding tot gespecialiseerde ontwikkelings-meercellige structuren die conidioforen worden genoemd, die lange ketens van haploïde conidia10 produceren die de groei onder gunstige omgevingsomstandigheden kunnen hervatten.
Een veelgebruikte methode voor het meten van filamenteuze schimmelgroei is het inenten van sporen op voedingsagar in een petrischaaltje en het macroscopisch meten van de diameter van de kolonie een paar dagen later11. De diameter /oppervlakte van de kolonie, het meest afhankelijk van veranderingen in myceliale groeisnelheid en minder van conidioforedichtheid 12, wordt dan gebruikt als een waarde van groei. Hoewel het meten van de grootte van schimmelpopulaties (kolonies) die op vaste oppervlakken groeit, voldoende is, is het zeker niet de meest nauwkeurige maat voor groei. Vergeleken met gemiddelden op populatieniveau (gemiddelden van de grootte van schimmelkolonies), kunnen metingen van één cel de heterogeniteit van een celpopulatie vastleggen en identificatie van nieuwe subpopulaties van cellen mogelijk maken, toestanden13, dynamiek, routes en de biologische mechanismen waarmee cellen reageren op endogene en omgevingsveranderingen14,15. Het monitoren van de groei en het fenotype van schimmelcellen door time-lapse-microscopie is misschien wel de meest gebruikte kwantitatieve benadering van eencellige observatie.
Hierin beschrijven we een labelvrij live beeldvormingsprotocol met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht (zoals fasecontrast, differentieel interferentiecontrast (DIC) en gepolariseerde microscopie) om beelden vast te leggen, die onafhankelijk van het gecombineerde gebruik van fluorescentiemicroscopie kunnen worden gebruikt om de polaire groei van A. nidulans-stammen in zowel ondergedompelde culturen als vaste media te analyseren en te kwantificeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

Het is algemeen bekend dat de koloniegroei van filamenteuze schimmels, meestal afhankelijk van veranderingen in de groeisnelheid van schimmeldraden / mycelia-apicale, macroscopisch wordt geschat op gestolde media door de koloniegrootte te vergelijken. Het is echter een uitdaging om de groeisnelheid van genetisch verschillende schimmelstammen of -stammen onder verschillende omgevings- / groeiomstandigheden (pH, temperatuur, koolstof- en stikstofbronnen, antibiotica, enz.) kwantitatief te meten. Het streven naar complementaire benaderingen om groeikinetiek te kwantificeren wordt dus verplicht om de groei van schimmelcellen beter te begrijpen. Bovendien is het bekend dat filamenteuze schimmels, waaronder Aspergillus spp., verschillende manieren van groei en differentiatie hebben onder sub-luchtomstandigheden op vaste media of ondergedompelde culturen. Hier beschrijven we een kwantitatieve microscopische methode voor het analyseren van de groeikinetiek van de modelschimmel Aspergillus nidulans, met behulp van live beeldvorming in zowel ondergedompelde culturen als vaste media. We leggen beelden vast, analyseren en kwantificeren groeisnelheden van verschillende schimmelstammen op een reproduceerbare en betrouwbare manier met behulp van een open source, gratis software voor biobeelden (bijv. Fiji), op een manier die geen voorafgaande beeldanalyse-expertise van de gebruiker vereist.

Volgens dit protocol hebben we verschillende beelden vastgelegd en geanalyseerd die overeenkomen met verschillende groei- / ontwikkelingsstadia van de filamenteuze schimmel A. nidulans. De gegevens die in deze studie werden gepresenteerd, werden verwerkt en geanalyseerd met behulp van de Fiji-software. Metingen werden opgeslagen als csv-bestanden, statistisch geanalyseerd en voorbereid als grafieken met behulp van commerciële statistische software en / of Python-programmeertaal met behulp van softwarebibliothek...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We presenteren een labelvrij live beeldvormingsprotocol met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht om beelden vast te leggen, groeikinetiek van de filamenteuze schimmel A. nidulans in zowel ondergedompelde culturen als vaste media te analyseren en te kwantificeren. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie.

Kwantitatieve analyse van de groeisnelheid van Aspergillus nidulans met behulp van live microscopie en open-source software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

In deze video beschrijven we een labelvrij live imaging protocol om beelden van de modelschimmel aspergillus nidulans vast te leggen, met behulp van microscopietechnieken voor doorgegeven licht. We gebruiken deze beelden om de groeikinetiek van aspergillus nidulans in zowel vloeibare als vaste media te analyseren en te kwantificeren. Een visuele weergave van dit protocol stelt gebruikers in staat om vertrouwd te raken met belangrijke stappen van het vastleggen van afbeeldingen en microscopie beeldverwerking.Een veelgebruikte methode om filamenteuze schimmelgroei te meten is twee ent schimmelsporen in een petrischaal met voedingsagar en om de diameter van de zich ontwikkelende kolonie een paar dagen later te meten. Deze aanpak is echter niet gevoelig genoeg om fijne groeiverschillen te kwantificeren. Daarom werden eencellige metingen met behulp van timelapse-microscopie ontwikkeld.Deze metingen zijn niet alleen in staat om nauwkeurige en kwantitatieve resultaten te leveren, maar ook om de groeidynamiek van verschillende cellen binnen een populatie weer te geven. Bovendien is deze aanpak gericht op een beter begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij schimmelgroeireacties op endogene en omgevingssignalen. Begin met het gieten van 15 milliliter vloeibare voedingsagar in petrischalen.Plaats het deksel op de bovenkant en laat het afkoelen. Gebruik UV-straling om platen te steriliseren. Voordat u de schimmelstam van belang uit een voorraad streept, verwarmt u de nodulating-lus in de Bunsen-brander totdat deze roodgloeiend is, koelt u de lus af door deze in de agar te steken.Vortex de buis en streep de lus over het oppervlak van het agar minimal medium aangevuld met de juiste voedingsbehoeften. Incubeer platen gedurende twee tot drie dagen bij 37 graden Celsius. Breng met behulp van een steriele tandenstoker een klein aantal conidia over door voorzichtig een enkele kolonie aan te raken op platen met complete media.Incubeer platen gedurende drie tot vier dagen bij 37 graden Celsius. Conidia van aspergillus nidulans, worden geoogst in een steriele vortexbuis van 1,5 milliliter, met 1,0 milliliter gedestilleerd autoclaaf gedestilleerd water met 0,05% volume per volume, Tween 80, voor het verminderen van het aantal conidia-klonten. Een aangepaste versie van de omgekeerde agar-methode wordt gebruikt voor het afbeelden van filamenteuze schimmels op het oppervlak van het agarmedium.Spot in eerste instantie 10 microliter aliquots van krachtig vortex conidiale suspensie, ongeveer twee keer 104 cellen per milliliter op petrischalen van 15 milliliter minimaal medium met één gewicht per volume agar. Incubeer de experimentele cultuur volgens het te onderzoeken ontwikkelingsstadium. Hier incuberen we drie dagen bij 30 graden Celsius.Snijd daarna een blok agar uit dat de kolonie bevat, met behulp van een steriel scalpel. Hier snijden we een wig van agar uit aan de kolonierand, keren om en plaatsen de agar-plak in een acht, goed schuiven. Breng 10 microliter aliquots van krachtig vortex conidiale suspensie van ongeveer twee keer 10 in de kracht van vier in de putten van een put dia met 200 microliter minimaal medium met de juiste supplementen.Incubateer voor de tijd en temperatuur die elke keer moeten worden onderzocht. De keuze van de microscoop hangt af van de beschikbare apparatuur. In ieder geval moet de microscoopop een omgekeerde fase, een omgevingskamer of op zijn minst een kamer met nauwkeurige luchttemperatuurregeling bevatten.Verwarm in eerste instantie de thermostaat en de microscoopkamer voor om de gewenste temperatuur te stabiliseren. Hier stellen we de temperatuur in op 30 graden Celsius. Schakel de microscoop, de scannervoeding, de laservoeding en de computer in en laad de beeldbewerkingssoftware.Plaats de eerder voorbereide goed voorbereide dia in het microscoopstadium en stel scherp. Zoek gezichtsvelden die geïsoleerde, niet overlappende cellen bevatten, of in ieder geval niet overvol, om groeimetingen tijdens beeldanalyse te vergemakkelijken. Selecteer de te gebruiken microscopietechniek voor doorlatend licht en activeer indien nodig de detector voor doorlatend licht en detectoren voor fluorescentie.Stel de microscoop in om beelden met de gewenste tijdsintervallen te verkrijgen en de acquisitie van tijdreeksen te starten. Het laden, visualiseren en verwerken van afbeeldingen wordt bereikt met de open source imageJ Fiji-software. Begin met het importeren van de afbeeldingen naar Fiji met behulp van plug-ins op een indeling.Selecteer de standaardkleurmodus en automatisch schalen. Om een tijdstempel en een schaalbalk als overlay te visualiseren, gaat u naar analyseren, gereedschappen, schaalbalk. Stel de gewenste parameters in met betrekking tot breedte, hoogte, kleur en locatie van de schaalbalk.Ga naar afbeelding, eigenschappen, om afbeeldingseigenschappen weer te geven in imageJ Fiji-software. Observeer frame-intervalinformatie. Hier gebruiken we een tijdsinterval van ongeveer 15 minuten en drukken we op ok.Ga vervolgens naar afbeelding, stapels, label en stel de juiste informatie in op interval. Stel de locatie van het label in door X en Y te wijzigen.Stel de maateenheid in de veldtekst in en druk op voorvertoning. Gebruik histogram matching voor verlichtingscorrectie tussen verschillende frames door het selecteren van beeld, aanpassen, bleekcorrectie, histogram matching.Er verschijnt een nieuw venster met gecorrigeerde verlichting. Gebruik de MtrackJ-plug-in bij plug-ins, MtrackJ, om groeiende hyphaltip te volgen Om de track toe te voegen, selecteert u de knop Toevoegen in de werkbalk en plaatst u het eerste punt op de hyphaltip met de linkermuisklik. De tijdreeks gaat automatisch naar het volgende frame.Als u het trackingproces wilt voltooien, dubbelklikt u met de muis op het laatste punt of drukt u op de escape-toets. Scrollend door de uitvoertabel, de belangrijkste kolom voor het berekenen van de groei van de hyphaltip, is de snelheid bij een bepaald frame. Veilig metingen bijhouden, bestand toevoegen, opslaan als, in de bestandsindeling van uw keuze, bijvoorbeeld CSV, importeer het opgeslagen bestand in uw spreadsheetprogramma en bereken de visualisatie en verdere tests.Druk op de filmknop om een film te genereren, RGB-kleurtype, met de frames met de tracks erin getekend, die kunnen worden gevisualiseerd in elke standaard multimediaspeler. Volgens dit protocol hebben we verschillende beelden vastgelegd en geanalyseerd die overeenkomen met verschillende groei- en ontwikkelingsstadia van de filamenteuze schimmel aspergillus nidulans. Figuur toont de vergelijking van wild type en azhAD Delta ngnA Delta groeisnelheid metingen.De azhAD Delta ngnA Delta is een dubbel verwijderde stam in twee genen die betrokken zijn bij de ontgifting en assimilatie van het toxische gevechtsproduct L zoals toegevoegd in twee carbonzuren. Het toont statistisch significante lagere groeisnelheidsmetingen in vergelijking met de wildtype stam in ondergedompelde vloeibare culturen. Dit verschil in groei is niet waarneembaar door het koloniegebied van deze twee stammen in vast minimaal medium te meten.Single cell, long-term live imaging is van grote waarde in de inspanning om ruimtelijke en temporele informatie van cellulaire eiwitdynamica te verkrijgen. Dit protocol is ook geschikt voor het uitvoeren van langdurige live cell imaging. Hier zien we kieming van conidia die het GFP-gelabelde kern eisosomaal eiwit PilA en het mRFP histonen H1 co-tot expressie brengen. Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van schimmelgroeikinetiek op een reproduceerbare en betrouwbare manier zonder de noodzaak van enige voorafgaande beeldanalyse-ervaring van de gebruiker.Dit protocol maakt een objectieve nauwkeurige kwantificering van schimmelgroei mogelijk.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kwantitatieve analyse van Random migratie van cellen met behulp van time-lapse video Microscopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Met behulp plusTipTracker Software om dynamiek van microtubuli Meet in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Groei Kegels

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...