Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch das Projekt "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) unterstützt, das im Rahmen der Aktion "Stärkung der Forschungs- und Innovationsinfrastruktur" durchgeführt wird, finanziert durch das operationelle Programm "Wettbewerbsfähigkeit, Unternehmertum und Innovation" (NSRP 2014-2020) und kofinanziert von Griechenland und der EU.

1. Inoculum-Zubereitung
HINWEIS: Alle Schritte sollten unter einem Laminar-Flow-Schrank ausgeführt werden.
<ol><li>Streifen Sie einen interessierenden Pilzstamm aus einem Glycerinvorrat (-80 °C) unter Verwendung einer sterilen Impfschleife auf Platten mit minimalen Medien (MM), die mit den entsprechenden Ernährungsanforderungen des untersuchten Stammes ergänzt werden [MM: 10,0 g/L Glukose, 20 ml/L Salzlösung (Salzlösung: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2 O, 76 g/L KH...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. 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A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

Die Überwachung des Pilzzellwachstums und des Phänotyps mittels Zeitraffermikroskopie ist ein leistungsfähiger Ansatz, um das zelluläre Verhalten in Echtzeit zu beurteilen und quantitativ und genau zu bestimmen, ob eine bestimmte medikamentöse Behandlung und / oder genetische Intervention zu nachweisbarem Zellwachstum oder phänotypischen Unterschieden im Laufe der Zeit führt.
In dieser Studie wurde eine zuverlässige Methode der Lebendzellbildgebung beschrieben, um die Pilzentwicklung z...

Fadenförmige Pilze sind von großer sozioökonomischer und ökologischer Bedeutung, da sie sowohl als industrielle/landwirtschaftliche Werkzeuge für die Enzym- und Antibiotikaproduktion1,2 als auch als Krankheitserreger von Kulturpflanzen3,Schädlingsinsekten4 und Menschen3von entscheidender Bedeutung sind. Darüber hinaus werden filamentöse Pilze wie Aspergillus nidulans häufig als Modellorganismen für die Grundlagenforschung verwendet, wie z.B. Studien in Genetik, Zell- und Evolutionsbiologie sowie für die Untersuchung der Hyphenverlängerung5. Filamentöse Pilze sind hochpolarisierte Organismen, die sich durch die kontinuierliche Versorgung mit Membranlipiden/Proteinen und die De-novo-Synthese der Zellwand an der ausdehnenden Spitze6 verlängern. Eine zentrale Rolle beim Wachstum der Hyphenspitze und der Aufrechterhaltung der Polarität ist eine spezialisierte Struktur namens "Spitzenkorper" (SPK), eine hochgeordnete Struktur, die hauptsächlich aus zytoskelettalen Komponenten und der polarisierten Verteilung des Golgi6,7,8besteht .
Umweltreize/-signale, wie Wasser-Luft-Grenzfläche, Licht, CO2-Konzentration und der Ernährungszustand sind für die Entwicklungsentscheidungen dieser Schimmelpilze verantwortlich9. In untergetauchten (flüssigen) Kulturen wird die Differenzierung von A. nidulans unterdrückt und das Wachstum erfolgt durch Hyphenspitzendehnung6. Während des vegetativen Wachstums keimen asexuelle Sporen (Konidien) durch apikale Ausdehnung und bilden ein undifferenziertes Netzwerk von miteinander verbundenen Hyphenzellen, dem Myzel, das unbegrenzt weiter wachsen kann, solange Nährstoffe und Platz verfügbar sind. Zum anderen verlängern sich auf festen Medienhypenspitzen und nach einer definierten Periode vegetativen Wachstums (Entwicklungskompetenz) wird die asexuelle Fortpflanzung eingeleitet und luftbildende Konidiophorstiele erstrecken sich aus spezialisierten Fußzellen des Myzels6. Diese führen zu spezialisierten entwicklungsübergreifenden mehrzelligen Strukturen, den sogenannten Konidiophoren, die lange Ketten haploider Konidien10 produzieren, die das Wachstum unter günstigen Umweltbedingungen wieder aufnehmen können.
Eine weit verbreitete Methode zur Messung des filamentösen Pilzwachstums besteht darin, Sporen auf Nährstoffagar in einer Petrischale zu impfen und einige Tage später den Durchmesser der Kolonie makroskopisch zu messen11. Der Durchmesser / die Fläche der Kolonie, die am meisten von Veränderungen der Myzelwachstumsrate und weniger von der Konidiophordichte12abhängt, wird dann als Wachstumswert verwendet. Obwohl die Messung der Pilzpopulation (Kolonie) auf festen Oberflächen durchaus ausreichend ist, ist sie keineswegs das genaueste Maß für das Wachstum. Im Vergleich zu Durchschnittswerten auf Populationsebene (Durchschnittswerte der Pilzkoloniegröße) können Einzelzellmessungen die Heterogenität einer Zellpopulation erfassen und die Identifizierung neuartiger Subpopulationen von Zellen,Zuständen 13,Dynamik, Signalwegen sowie den biologischen Mechanismen ermöglichen, mit denen Zellen auf endogene und Umweltveränderungen reagieren14,15. Die Überwachung des Pilzzellwachstums und des Phänotyps durch Zeitraffermikroskopie ist wohl der am weitesten verbreitete quantitative Einzelzellbeobachtungsansatz.
Hierin beschreiben wir ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll unter Verwendung von Durchlichtmikroskopietechniken (wie Phasenkontrast, differentialer Interferenzkontrast (DIC) und polarisierter Mikroskopie) zur Aufnahme von Bildern, die unabhängig von der kombinierten Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse und Quantifizierung des polaren Wachstums von A. nidulans-Stämmen sowohl in untergetauchten Kulturen als auch in festen Medien verwendet werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

Es ist gut bekannt, dass das Koloniewachstum von filamentösen Pilzen, das hauptsächlich von Veränderungen der hyphen/ myzelen apikalen Wachstumsrate abhängt, makroskopisch auf erstarrten Medien durch Vergleich der Koloniegröße geschätzt wird. Die Wachstumsrate genetisch unterschiedlicher Pilzstämme oder -stämme unter verschiedenen Umwelt-/Wachstumsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Antibiotika usw.) quantitativ zu messen, ist jedoch eine Herausforderung. Daher wird die Verfolgung komplementärer Ansätze zur Quantifizierung der Wachstumskinetik obligatorisch, um das Wachstum von Pilzzellen besser zu verstehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass filamentöse Pilze, einschließlich Aspergillus spp., unter Bedingungen unter der Luft auf festen Medien oder untergetauchten Kulturen unterschiedliche Wachstums- und Differenzierungsmodi aufweisen. Hier beschreiben wir eine quantitative mikroskopische Methode zur Analyse der Wachstumskinetik des Modellpilzes Aspergillus nidulansunter Verwendung von Live-Bildgebung sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien. Wir erfassen Bilder, analysieren und quantifizieren Wachstumsraten verschiedener Pilzstämme reproduzierbar und zuverlässig mit einer Open-Source-Software für Biobilder (z. B. Fidschi), und zwar auf eine Weise, die keine vorherige Bildanalyse-Expertise des Benutzers erfordert.

Nach diesem Protokoll haben wir verschiedene Bilder aufgenommen und analysiert, die verschiedenen Wachstums- / Entwicklungsstadien des fadenförmigen Pilzes A. nidulansentsprechen. Die in dieser Studie vorgestellten Daten wurden mit der Fidschi-Software verarbeitet und analysiert. Die Messungen wurden als CSV-Dateien gespeichert, statistisch analysiert und als Diagramme mit kommerzieller Statistiksoftware und / oder Python-Programmiersprache unter Verwendung von Softwarebibliotheken wie Pandas, Numpy, Statsmodel...

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Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Wir präsentieren ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll mit Durchlichtmikroskopie-Techniken, um Bilder zu erfassen, die Wachstumskinetik des filamentösen Pilzes A. nidulans sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann in Verbindung mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.

Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

In diesem Video beschreiben wir ein labelfreies Live-Imaging-Protokoll zur Aufnahme von Bildern des Modellpilzes Aspergillus nidulans mit Hilfe von Durchlichtmikroskopietechniken. Wir verwenden diese Bilder, um die Wachstumskinetik von Aspergillus nidulans in flüssigen und festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Eine visuelle Darstellung dieses Protokolls ermöglicht es benutzern, sich mit wichtigen Schritten der Bilderfassung und Mikroskopie-Bildverarbeitung vertraut zu machen.Eine gängige Methode zur Messung des Fadenpilzwachstums sind zwei impfende Pilzsporen in einer Petrischale, die Nährstoffagar enthält, und einige Tage später den Durchmesser der sich entwickelnden Kolonie zu messen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht sensibel genug, um feine Wachstumsunterschiede zu quantifizieren. Daher wurden Einzelzellmessungen mittels Zeitraffermikroskopie entwickelt.Diese Messungen sind nicht nur in der Lage, genaue und quantitative Ergebnisse zu liefern, sondern auch die Wachstumsdynamik verschiedener Zellen innerhalb einer Population widerzuspiegeln. Darüber hinaus zielt dieser Ansatz darauf ab, die molekularen Mechanismen besser zu verstehen, die an Pilzwachstumsreaktionen auf endogene und Umweltsignale beteiligt sind. Beginnen Sie, indem Sie 15 Milliliter flüssiges Nährstoffagar in Petrischalen gießen.Legen Sie den Deckel auf die Oberseite und lassen Sie ihn abkühlen. Verwenden Sie UV-Strahlung, um Platten zu sterilisieren. Bevor Sie die interessierende Pilzsorte aus einem Schaft herausstreifen, erhitzen Sie die Nickschleife im Bunsenbrenner, bis sie glühend heiß ist, kühlen Sie die Schlaufe, indem Sie sie in das Agar stechen.Wirbeln Sie das Röhrchen und streifen Sie die Schleife über die Oberfläche des Agar-Minimalmediums, ergänzt mit den entsprechenden Ernährungsbedürfnissen. Inkubieren Sie Platten für zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine kleine Anzahl von Konidien, indem Sie eine einzelne Kolonie sanft auf Platten mit vollständigen Medien berühren.Inkubieren Sie die Platten drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius. Konidien von Aspergillus nidulans werden in einem sterilen 1,5-Milliliter-Wirbelrohr geerntet, wobei 1,0 Milliliter autoklaviertes Wasser mit 0,05% Volumen pro Volumen, Tween 80, zur Verringerung der Anzahl der Konidienklumpen enthalten. Eine modifizierte Version der invertierten Agarmethode wird zur Abbildung von filamentösen Pilzen auf der Oberfläche des Agarmediums verwendet.Entdecken Sie zunächst 10 Mikroliter-Aliquoten von kräftig vortex konidialer Suspension, etwa zweimal 104 Zellen pro Milliliter auf Petrischalen von 15 Millilitern minimalem Medium mit einem Gewicht pro Volumen Agar. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem zu untersuchenden Entwicklungsstadium. Hier inkubieren wir drei Tage bei 30 Grad Celsius.Danach schneiden Sie einen Agarblock, der die Kolonie enthält, mit einem sterilen Skalpell heraus. Hier schneiden wir einen Keil aus Agar am Kolonierand aus, kehren um und legen die Agarscheibe in eine acht, gut gleiten. Übertragen Sie 10 Mikroliter Aliquoten von kräftig vortex konidialer Suspension von etwa zwei mal 10 in der Stärke von vier in den Vertiefungen eines Bohrschiebers mit 200 Mikrolitern minimalem Medium mit den entsprechenden Ergänzungen.Inkubieren Sie für die Zeit und Temperatur, die jedes Mal untersucht werden sollen. Die Wahl des Mikroskops hängt von der verfügbaren Ausrüstung ab. In jedem Fall sollte der Mikroskopaufstand eine umgekehrte Stufe, eine Umweltkammer oder zumindest einen Raum mit präziser Lufttemperaturregelung umfassen.Heizen Sie zunächst den Thermostat und die Mikroskopkammer vor, um die gewünschte Temperatur zu stabilisieren. Hier stellen wir die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein. Schalten Sie das Mikroskop, die Scannerleistung, die Laserleistung und den Computer ein und laden Sie die Bildgebungssoftware.Legen Sie den zuvor vorbereiteten Gut-Objektträger in den Mikroskopstand und fokussieren Sie. Finden Sie Sichtfelder, die isolierte, nicht überlappende Zellen oder zumindest nicht überfüllt enthalten, um Wachstumsmessungen während der Bildanalyse zu erleichtern. Wählen Sie die zu verwendenden Durchlichtmikroskopietechnik aus und aktivieren Sie bei Bedarf den Durchlichtdetektor sowie Detektoren für Die Fluoreszenz.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Bilder in den gewünschten Zeitintervallen erfasst werden, und starten Sie die Zeitreihenerfassung. Das Laden, Visualisieren und Verarbeiten von Bildern erfolgt mit der Open Source software imageJ Fiji. Beginnen Sie mit dem Import der Bilder nach Fidschi mit Plugins in einem Format.Wählen Sie den Standardfarbmodus und die automatische Skalierung aus. Um einen Zeitstempel und eine Maßstabsleiste als Overlay zu visualisieren, gehen Sie zu Analyse, Tools, Skalierungsleiste. Legen Sie die gewünschten Parameter in Bezug auf Breite, Höhe, Farbe und Position der Skalierungsleiste fest.Gehen Sie zu Bild, Eigenschaften, um Bildeigenschaften in imageJ Fiji Software anzuzeigen. Beobachten Sie frame-Intervallinformationen. Hier verwenden wir ein Zeitintervall von ca. 15 Minuten und drücken OKAY.Gehen Sie dann zu Bild, Stapel, Beschriftung und legen Sie die richtigen Informationen auf Intervall fest. Legen Sie die Position der Beschriftung fest, indem Sie X und Y ändern.Legen Sie die Maßeinheit im Feldtext fest und drücken Sie die Vorschau. Verwenden Sie die Histogrammanpassung für die Beleuchtungskorrektur zwischen verschiedenen Frames, indem Sie Bild, Anpassung, Bleichkorrektur und Histogrammabgleich auswählen.Ein neues Fenster mit korrigierter Beleuchtung erscheint. Verwenden Sie das MtrackJ-Plugin bei Plugins, MtrackJ, um wachsende Hyphenspitze zu verfolgen Um den Track hinzuzufügen, wählen Sie die Schaltfläche Hinzufügen in der Symbolleiste und platzieren Sie den ersten Punkt mit dem linken Mausklick auf der Hyphenspitze. Die Zeitreihe wird automatisch zum nächsten Frame verschoben.Um den Tracking-Vorgang abzuschließen, doppelklicken Sie mit der Maus auf den letzten Punkt oder drücken Sie die Esc-Taste. Das Scrollen der Ausgabetabelle, der wichtigsten Spalte zur Berechnung des Hyphenspitzenwachstums, ist die Geschwindigkeit bei einem bestimmten Frame. Verfolgen Sie Messungen sicher, fügen Sie eine Datei hinzu, speichern Sie unter, in das Dateiformat Ihrer Wahl, z. B. CSV, importieren Sie die gespeicherte Datei in Ihr Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die Visualisierung und weitere Tests.Drücken Sie die Filmtaste, um einen Film vom RGB-Farbtyp zu generieren, der die Frames mit den darin gezeichneten Spuren enthält, die in jedem Standard-Multimedia-Player visualisiert werden können. Nach diesem Protokoll haben wir verschiedene Bilder aufgenommen und analysiert, die verschiedenen Wachstums- und Entwicklungsstadien des Fadenpilzes Aspergillus nidulans entsprechen. Die Abbildung zeigt den Vergleich von Wildtyp- und azhAD Delta ngnA Delta Wachstumsratenmessungen.Der azhAD Delta ngnA Delta ist ein doppelt gelöschter Stamm in zwei Genen, der an der Entgiftung und Assimilation des toxischen Kampfmittels L beteiligt ist, wie es in zwei Carbonsäuren zugesetzt wird. Es zeigt statistisch signifikante Messungen mit niedrigerer Wachstumsrate im Vergleich zum Wildtypstamm in untergetauchten Flüssigkeitskulturen. Dieser Wachstumsunterschied ist nicht nachweisbar, wenn die Koloniefläche dieser beiden Stämme in festem minimalen Medium gemessen wird.Einzelzellige Langzeit-Live-Bildgebung ist von erheblichem Wert bei der Gewinnung räumlicher und zeitlicher Informationen über die Dynamik zellulärer Proteine. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Durchführung von Langzeit-Lebendzellbildgebung. Hier sehen wir die Keimung von Konidien, die das GFP-markierte eisosomale Kernprotein PilA und das mRFP-Histonen H1 co-exprimieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur reproduzierbaren und zuverlässigen Analyse der Pilzwachstumskinetik vor, ohne dass eine vorherige Bildanalyseerfahrung des Benutzers erforderlich ist.Dieses Protokoll ermöglicht eine objektive, genaue Quantifizierung des Pilzwachstums.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Forschung

Biologie

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

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Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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