Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הפרויקט "תשתית מחקר יוונית להדמיה וניטור תהליכים ביולוגיים בסיסיים (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) המיושמת במסגרת הפעולה "חיזוק תשתית המחקר והחדשנות", הממומנת על ידי התוכנית התפעולית "תחרותיות, יזמות וחדשנות" (NSRF 2014-2020) ובמימון משותף של יוון ו- E. U.

1. הכנה לאנוקולום
הערה: כל השלבים צריכים להתבצע תחת ארון זרימה למינארי.
<ol><li>פס החוצה זן פטרייתי של עניין, ממלאי גליצל (-80 °C) באמצעות לולאת חיסון סטרילית, על לוחות של מדיה מינימלית (MM) בתוספת הדרישות התזונתיות המתאימות הרלוונטיות לזן שנבדק [MM: 10.0 גרם / L גלוקוז, פתרון מלח 20 מ"ל / ל?...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus,+Fusarium+and+Mucor.">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li><li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Pathogenic+Fungi:+Genomics,+Molecular+Interactions,+and+Genetic+Improvements.">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li><li>Etxebeste, O., Espeso, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans+in+the+post-genomic+era:+a+top-model+filamentous+fungus+for+the+study+of+signaling+and+homeostasis+mechanisms.">Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms.</a> International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).</li><li>Riquelme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Morphogenesis,+from+the+Polarized+Growth+of+Hyphae+to+Complex+Reproduction+and+Infection+Structures.">Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).</li><li>Athanasopoulos, A., Andr&#233;, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+plasma+membrane+domains.">Fungal plasma membrane domains.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2019).</li><li>Pantazopoulou, A., Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Dynamics+of+the+Aspergillus+nidulans+Golgi+during+Apical+Extension+and+Mitosis.">Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).</li><li>Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+global+gene+expression+and+secondary+metabolite+accumulation+during+light-dependent+Aspergillus+nidulans+development.">Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development.</a> Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).</li><li>Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Development+in+Aspergillus+nidulans+and+Aspergillus+fumigatus.">Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus.</a> Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).</li><li>Tomkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth:+The+petri+dish+method.">Measuring growth: The petri dish method.</a> Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).</li><li>Gifford, D. R., Schoustra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+colony+population+growth+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).</li><li>Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+live+cell+behaviour:+Traditional+label-free+and+quantitative+phase+imaging+approaches.">Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 89-95 (2017).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+microscopy+for+non-invasive+live+cell+population+monitoring.">Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring.</a> Scientific Reports. 11, (2021).</li><li>Chessel, A., Carazo Salas, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+observing+to+predicting+single-cell+structure+and+function+with+high-throughput/high-content+microscopy.">From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy.</a> Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).</li><li>Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Aspergillus+nidulans:+meiotic+progeny+for+genetic+analysis+and+strain+construction.">Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction.</a> Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).</li><li>Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi+Using+Vital+Fluorescent+Dyes+and+Confocal+Microscopy.">Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy.</a> Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).</li><li>Trinci, A. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinetic+Study+of+the+Growth+of+Aspergillus+nidulans+and+Other+Fungi.">A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi.</a> Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).</li><li>Lichius, A., Zeilinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Membrane+and+Cell+Wall+Selective+Fluorescent+Dyes+for+Live-Cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi.">Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).</li><li>Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immersion+oil+for+high-resolution+live-cell+imaging+at+37&#176;C:+optical+and+physical+characteristics.">Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37&#176;C: optical and physical characteristics.</a> Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+of+Zebrafish+Embryonic+Development.">In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development.</a> CSH protocols. 2007, (2007).</li><li>Walzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+low-cost+long-term+live-cell+imaging+platform+for+biomedical+research+and+education.">A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education.</a> Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64.">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li><li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy:+CellStar+and+the+Evaluation+Platform.">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).</li><li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה בזמן לשגות היא גישה רבת עוצמה כדי להעריך את ההתנהגות התאית בזמן אמת וכמותית ומדויקת לקבוע אם טיפול תרופתי מסוים ו/או התערבות גנטית גורמים לצמיחת תאים הניתנים לזיהוי או הבדלים פנוטיפיים לאורך זמן.
במחקר זה תוארה מתודולוג...

פטריות סיבים הן בעלי חשיבות חברתית-כלכלית ואקולוגית רבה, הן חיוניות ככלים תעשייתיים / חקלאיים לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה1,2 והן כפתוגנים של צמחייבול 3, חרקי מזיקים4 ובני אדם3. יתר על כן, פטריות חוטיות כגון אספרגילוס nidulans נמצאים בשימוש נרחב כמו אורגניזמים מודל למחקר בסיסי, כגון מחקרים בגנטיקה, תאים וביולוגיה אבולוציונית, כמו גם לחקר הרחבת hyphal5. פטריות חוטיות הן אורגניזמים מקוטבים מאוד המאריכים דרך האספקה המתמשכת של שומנים / חלבונים ממברנה ואת סינתזת דה נובו של דופן התא בקצה המאריך6. תפקיד מרכזי בצמיחת קצה ההיפהל ותחזוקת הקוטביות הוא מבנה מיוחד בשם 'Spitzenkorper' (SPK), מבנה מסודר מאוד המורכב בעיקר מרכיבי שלד והתפלגות מקוטבת של Golgi6,7,8.
גירויים / אותות סביבתיים, ממשק אוויר מים כגון, אור, ריכוז CO2, ואת המצב התזונתי אחראים על ההחלטות ההתפתחותיות שנעשו על ידי תבניות אלה9. בתרבויות שקועות (נוזליות) הבידול של A. nidulans מודחק והצמיחה מתרחשת על ידי התארכות טיפ היפלה6. במהלך צמיחה וגטטיבית, נבגים א-מיניים (conidia) לנבוט על ידי הרחבה apical, יצירת רשת לא מופרעת של תאים היפל מחוברים, תפטיר, אשר עשוי להמשיך לגדול ללא הגבלת זמן כל עוד חומרים מזינים ומרחב זמינים. מצד שני, על טיפים היפל מדיה מוצק להאריך ולאחר תקופה מוגדרת של צמיחה וגטטיבית (יכולת התפתחותית), רבייה א-מינית הוא יזם וגבעולי conidiophore אוויר להרחיב מתאי רגל מיוחדים של תפטיר6. אלה מעוררים מבנים רב תאיים התפתחותיים מיוחדים הנקראים conidiophores, המייצרים שרשראות ארוכות של conidia הפלואיד10 שיכולים להתחיל מחדש את הצמיחה בתנאים סביבתיים נוחים.
שיטה נפוצה למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא לחסן נבגים על אגר מיזיני הכלול בצלחת פטרי ולמדוד באופן מקרוסקופי את קוטר המושבה כמה ימים לאחרמכן 11. הקוטר / אזור של המושבה, התלוי ביותר בשינויים בקצב הצמיחה שלי ושל תריסתיים ופחות בצפיפות conidiophore12, משמש לאחר מכן כערך של צמיחה. אמנם, מדידת גודל האוכלוסייה הפטרייתית (מושבה) גדל על משטחים מוצקים הוא די הולם, זה בשום אופן לא המדד המדויק ביותר של צמיחה. בהשוואה לממוצעי רמת האוכלוסייה (ממוצעים של גודל מושבה פטרייתית), מדידות תאים בודדים יכולות ללכוד את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים ולאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות חדשניות של תאים, מדינות13, דינמיקה, מסלולים כמו גם המנגנונים הביולוגיים שבאמצעותם תאים מגיבים לשינויים אנדוגניים וסביבתיים14,15. ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות היא ללא ספק הגישה התצפית כמותית של תא יחיד המועסק ביותר.
להלן, אנו מפרטים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות (כגון ניגודיות פאזה, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ומיקרוסקופיה מקוטבת) כדי ללכוד תמונות, אשר ללא תלות בשימוש המשולב במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות ניתן להשתמש כדי לנתח ולכמת את הצמיחה הקוטבית של זני A. nidulans הן בתרבויות שקועות והן במדיה מוצקה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

זה מבוסס היטב כי צמיחת המושבה של פטריות חוטים, תלוי בעיקר בשינויים בהייפאה / תפטירי שיעור הצמיחה apical, מוערך מקרוסקופית על מדיה מוצקה על ידי השוואת גודל המושבה. עם זאת, כדי למדוד כמותית את קצב הצמיחה של זנים פטרייתיים שונים מבחינה גנטית או זנים בתנאי סביבה / צמיחה שונים (pH, טמפרטורה, פחמן ומקורות חנקן, אנטיביוטיקה, וכו ') הוא מאתגר. לכן, המרדף אחר גישות משלימות לכמת קינטיקה צמיחה הופך חובה על מנת להבין טוב יותר את צמיחת התא הפטרייתי. יתר על כן, ידוע כי פטריות חוטיות, כולל אספרגילוס spp., יש מצבים ברורים של צמיחה ובידול בתנאים תת-אוויריים על מדיה מוצקה או תרבויות שקועות. כאן, אנו מפרטים שיטה מיקרוסקופית כמותית לניתוח קינטיקה צמיחה של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות הדמיה חיה הן תרבויות שקועות ומדיה מוצקה. אנו לוכדים תמונות, מנתחים וכימתים שיעורי גדילה של זנים פטרייתיים שונים באופן ניתן לשחזור ואמין באמצעות קוד פתוח, תוכנה חופשית לביו-תמונות (למשל, פיג'י), באופן שאינו דורש מומחיות קודמת בניתוח תמונה מהמשתמש.

בעקבות פרוטוקול זה, תפסנו וניתחנו תמונות שונות המתאימות לשלבי צמיחה / התפתחות שונים של הפטרייה הסיבית A. nidulans. הנתונים שהוצגו במחקר זה עובדו ונותחו באמצעות תוכנת פיג'י. המדידות נשמרו כקבצי csv, נותחו סטטיסטית והוכנו כגרפים באמצעות תוכנה סטטיסטית מסחרית ו/או שפת תכנות פייתון באמצעות ספר?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות כדי ללכוד תמונות, לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של הפטרייה חוטית A. nidulans הן בתרבויות שקועות ומדיה מוצקה. פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תווית כדי ללכוד תמונות של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועבר. אנו משתמשים בתמונות אלה כדי לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של nidulans אספרגילוס הן במדיה נוזלית מוצקה. ייצוג חזותי של פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים להכיר שלבים משמעותיים של לכידת תמונה ועיבוד תמונה מיקרוסקופית.שיטה נפוצה המשמשת למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא שני נבגים פטרייתיים מחסן בצלחת פטרי המכילה אגר מיזינים ולמדוד את קוטר המושבה המתפתחת כמה ימים לאחר מכן. עם זאת, גישה זו אינה רגישה מספיק כדי לכמת הבדלי צמיחה עדינים. לכן, מדידות תא בודד באמצעות מיקרוסקופיית זמן לשגות פותחו.מדידות אלה מסוגלות לא רק לספק תוצאות מדויקות וכמותיות, אלא גם לשקף דינמיקת צמיחה של תאים שונים בתוך אוכלוסייה. יתר על כן, גישה זו שואפת להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתגובות צמיחה פטרייתיות לאותות אנדוגניים וסביבתיים. התחל על ידי שפיכת 15 מיליליטר של אגר מיזים נוזלי לתוך מנות פטרי.מניחים את המכסה על החלק העליון ומאפשרים לו להתקרר. השתמש בקרינת UV כדי לעקר צלחות. לפני פסים את המתח הפטרייתי של עניין מן המניה, לחמם את לולאת הנהון מבער Bunsen עד שהוא חם אדום, לקרר את הלולאה על ידי דקירתו לתוך אגר.מערבולת את הצינור ופס הלולאה על פני השטח של המדיום המינימלי אגר בתוספת הדרישות התזונתיות המתאימות. לוחות דגירה במשך יומיים עד שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. באמצעות קיסם סטרילי, להעביר מספר קטן של conidia על ידי נגיעה עדינה מושבה אחת לצלחות של מדיה מלאה.לוחות דגירה במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. Conidia של nidulans אספרגילוס, נקצרים בצינור מערבולת סטרילי 1.5 מיליליטר, עם 1.0 מיליליטר של מים מזוקקים autoclave המכיל 0.05% נפח לכל נפח, Tween 80, להפחתת מספר גושי conidia. גרסה מותאמת של שיטת אגר הפוכה משמשת להדמיית פטריות חוטיות על משטח בינוני אגר.בתחילה לזהות 10 aliquots microliter של השעיה conidial מערבולת נמרצת, בערך פעמיים 104 תאים למיליליטר על מנות פטרי של 15 מיליליטר בינוני מינימלי עם משקל אחד לכל אגר נפח. לדגור על התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שיש לחקור. כאן אנו מדגירים במשך שלושה ימים ב 30 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, פרוס בלוק של אגר המכיל את המושבה, באמצעות אזמל סטרילי. כאן אנחנו חותכים טריז של אגר בשולי המושבה, להפוך ולהניח את פרוסת אגר לשמונה, גם להחליק. העבר 10 aliquots microliter של השעיה conidial מערבולת נמרצת של כ פעמיים כפול 10 בכוח של ארבע בבארות של שקופית באר המכילה 200 microliters של בינוני מינימלי עם תוספי המתאים.דגירה לזמן ולטמפרטורה שיש לבדוק בכל פעם. הבחירה במיקרוסקופ תלויה בציוד הזמין. בכל מקרה, המיקרוסקופ שהוקם צריך לכלול שלב הפוך, תא סביבתי, או לפחות חדר עם בקרת טמפרטורת אוויר מדויקת.בתחילה לחמם את התרמוסטט ואת תא המיקרוסקופ כדי לייצב את הטמפרטורה הרצויה. כאן אנו קובעים את הטמפרטורה על 30 מעלות צלזיוס. הפעל את המיקרוסקופ, את כוח הסורק, את כוח הלייזר והמחשב, וטען את תוכנת ההדמיה.מקם את החלקה המוכנה היטב שהוכנה בעבר בשלב המיקרוסקופ ובמוקד. מצא שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים, לא חופפים, או לפחות לא צפופים, כדי להקל על מדידות צמיחה במהלך ניתוח תמונה. בחר את טכניקת מיקרוסקופיית האור המשודרת לשימוש ולהפעיל את גלאי האור המשודר, כמו גם גלאים עבור פלואורסצנטיות בעת הצורך.הגדר את המיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות במרווחי זמן רצויים ולהתחיל את רכישת סדרת זמן. טעינה, תצוגה חזותית ועיבוד של תמונות מתבצעת עם תוכנת קוד פתוח של ג'יי פיג'י. התחל על-ידי ייבוא התמונות לפיג'י באמצעות תוספים בתבנית.בחר את מצב הצבע וקנה המידה האוטומטי המהווים ברירת מחדל. כדי לדמיין חותמת זמן וסרגל קנה מידה כשכבת-על עבור לנתח, כלים, סרגל קנה מידה. הגדר את הפרמטרים הרצויים לגבי רוחב, גובה, צבע ומיקום של סרגל קנה המידה.עבור אל תמונה, מאפיינים, כדי להציג מאפייני תמונה בתוכנת imageJ Fiji. שים לב למידע מרווח המסגרות. כאן אנו משתמשים במרווח זמן של כ -15 דקות ולחצו בסדר.לאחר מכן עבור אל תמונה, ערימות, תווית והגדר את המידע הנכון למרווח זמן. הגדר את מיקום התווית על-ידי שינוי X ו- Y.הגדר את יחידת המדידה בטקסט השדה ולחץ על תצוגה מקדימה. השתמש בהתאמת היסטוגרמה לתיקון תאורה בין מסגרות שונות על-ידי בחירת תמונה, כוונון, תיקון אקונומיקה, התאמת היסטוגרמה.מופיע חלון חדש עם תאורה מתוקנת. השתמש תוסף MtrackJ בתוספים, MtrackJ, כדי לעקוב אחר קצה hyphal גדל כדי להוסיף את הרצועה, בחר את לחצן הוספה בסרגל הכלים ומקם את הנקודה הראשונה בקצה hyphal באמצעות הלחיצה השמאלית של העכבר. סידרת הזמן תעבור באופן אוטומטי למסגרת הבאה.כדי להשלים את תהליך המעקב, לחץ פעמיים על העכבר בנקודה הסופית או הקש על מקש המילוט. גלילת טבלת הפלט, העמודה החשובה ביותר לחישוב צמיחת קצה ההיפהל, היא המהירות בכל מסגרת נתונה. מעקב בטוח אחר מדידות, הוספת קובץ, שמירה כ, לתבנית הקובץ לפי בחירתך, לדוגמה, CSV, ייבוא הקובץ השמור לתוכנית הגיליון האלקטרוני שלך וחישוב הפריט החזותי ובדיקות נוספות.לחץ על לחצן הסרט כדי ליצור סרט, סוג צבע RGB, המכיל את המסגרות עם הרצועות שצוירו לתוכם, אשר ניתן לדמיין בכל נגן מולטימדיה סטנדרטי. בעקבות פרוטוקול זה, תפסנו וניתחנו תמונות שונות המתאימות לשלבי צמיחה והתפתחות שונים של הפטרייה הסיבית אספרגילוס nidulans. איור מציג את ההשוואה של מדידות קצב הצמיחה של סוג הבר וקצב הצמיחה של דלתא של azhAD Delta.דלתא דלתא azhAD דלתא היא זן שנמחק כפול בשני גנים מעורבים ניקוי רעלים והטמעה של מוצר הלוחם הרעיל L כפי שנוספו בשתי חומצה קרבוקסילית. זה מראה מדידות קצב צמיחה נמוכות משמעותיות סטטיסטית בהשוואה לזן סוג הבר בתרביות נוזליות שקועות. הבדל זה בצמיחה אינו ניתן לזיהוי על ידי מדידת אזור המושבה של שני זנים אלה במדיום מינימלי מוצק.לתא יחיד, הדמיה חיה לטווח ארוך יש ערך משמעותי במאמץ להשיג מידע מרחבי וטמפורלי של דינמיקת חלבונים תאיים. פרוטוקול זה מתאים גם לביצוע הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים. כאן אנו רואים נביטה של conidia שיתוף מבטא את GFP שכותרתו חלבון eisosomal הליבה PilA ואת היסטונן mRFP H1. כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח קינטיקה גדילה פטרייתית באופן לשחזור ואמין ללא צורך בכל ניסיון ניתוח תמונה קודם מהמשתמש.פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויק אובייקטיבי של צמיחה פטרייתית.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

ניתוח כמותי של הגירה אקראית של תאים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...