Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal progetto "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) che è implementato nell'ambito dell'azione "Rafforzamento dell'infrastruttura di ricerca e innovazione", finanziato dal programma operativo "Competitività, imprenditorialità e innovazione" (NSRF 2014-2020) e cofinanziato dalla Grecia e dall'UE.

1. Preparazione dell'inoculo
NOTA: tutti i passaggi devono essere eseguiti in un armadio a flusso laminare.
<ol><li>Strisciare il ceppo fungino di interesse, da un ceppo di glicerolo (-80 °C) utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, su piastre di mezzi minimi (MM) integrate con i requisiti nutrizionali appropriati relativi al ceppo esaminato [MM: 10,0 g/L di glucosio, 20 mL/L di soluzione salina (soluzione salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2</...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. 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A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è un approccio potente per valutare il comportamento cellulare in tempo reale e quantitativamente e determinare con precisione se un particolare trattamento farmacologico e / o intervento genetico si traduce in una crescita cellulare rilevabile o differenze fenotipiche nel tempo.
In questo studio, è stata descritta una metodologia affidabile di imaging a cellule vive per misurare e analizzare ...

I funghi filamentosi sono di grande importanza socioeconomica ed ecologica, essendo sia cruciali come strumenti industriali / agricoli per la produzione di enzimi e antibiotici1,2 e come agenti patogeni delle piante coltivate3,insetti parassiti4 e umani3. Inoltre, i funghi filamentosi come Aspergillus nidulans sono ampiamente utilizzati come organismi modello per la ricerca fondamentale, come studi in genetica, biologia cellulare ed evolutiva, nonché per lo studio dell'estensione ifale5. I funghi filamentosi sono organismi altamente polarizzati che si allungano attraverso l'apporto continuo di lipidi/proteine di membrana e la sintesi de novo della parete cellulare alla punta estensente6. Un ruolo centrale nella crescita della punta ifale e nel mantenimento della polarità è una struttura specializzata chiamata 'Spitzenkorper' (SPK), una struttura altamente ordinata costituita principalmente da componenti citoscheletriche e dalla distribuzione polarizzata del Golgi6,7,8.
Stimoli /segnali ambientali, come l'interfaccia acqua-aria, la luce, la concentrazione di CO2 e lo stato nutrizionale sono responsabili delle decisioni di sviluppo prese da queste muffe9. Nelle colture sommerse (liquide) la differenziazione di A. nidulans è repressa e la crescita avviene per allungamento della punta ifale6. Durante la crescita vegetativa, le spore asessuate (conidi) germinano per estensione apicale, formando una rete indifferenziata di cellule ifali interconnesse, il micelio, che può continuare a crescere indefinitamente finché i nutrienti e lo spazio sono disponibili. D'altra parte, sui mezzi solidi le punte ifali si allungano e dopo un periodo definito di crescita vegetativa (competenza evolutiva), viene avviata la riproduzione asessuata e i gambi conidiofori aerei si estendono da cellule del piede specializzate del micelio6. Questi danno origine a strutture multicellulari di sviluppo specializzate chiamate conidiofori, che producono lunghe catene di conidiaploidi 10 che possono riavviare la crescita in condizioni ambientali favorevoli.
Un metodo ampiamente utilizzato per misurare la crescita fungina filamentosa è quello di inoculare le spore sull'agar nutriente contenuto in una capsula di Petri e misurare macroscopicamente il diametro della colonia pochi giorni dopo11. Il diametro/area della colonia, più dipendente dalle variazioni del tasso di crescita miceliale e meno dalla densità conidioforica12,viene quindi utilizzato come valore di crescita. Sebbene la misurazione delle dimensioni della popolazione fungina (colonia) che cresce su superfici solide sia abbastanza adeguata, non è affatto la misura più accurata della crescita. Rispetto alle medie del livello di popolazione (medie delle dimensioni delle colonie fungine), le misurazioni delle singole cellule possono catturare l'eterogeneità di una popolazione cellulare e consentire l'identificazione di nuove sotto-popolazioni di cellule, stati13, dinamiche,percorsi e i meccanismi biologici con cui le cellule rispondono ai cambiamenti endogeni e ambientali14,15. Il monitoraggio della crescita e del fenotipo delle cellule fungine mediante microscopia time-lapse è probabilmente l'approccio quantitativo di osservazione a singola cellula più ampiamente utilizzato.
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging dal vivo privo di etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa (come contrasto di fase, contrasto di interferenza differenziale (DIC) e microscopia polarizzata) per acquisire immagini, che indipendentemente dall'uso combinato della microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per analizzare e quantificare la crescita polare dei ceppi di A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

È ben noto che la crescita delle colonie di funghi filamentosi, per lo più dipendente dai cambiamenti nel tasso di crescita apicale di ife/micelio, è stimata macroscopicamente su mezzi solidificati confrontando le dimensioni della colonia. Tuttavia, misurare quantitativamente il tasso di crescita di ceppi o ceppi fungini geneticamente diversi in diverse condizioni ambientali / di crescita (pH, temperatura, fonti di carbonio e azoto, antibiotici, ecc.) è impegnativo. Pertanto, la ricerca di approcci complementari per quantificare la cinetica di crescita diventa obbligatoria al fine di comprendere meglio la crescita delle cellule fungine. Inoltre, è ben noto che i funghi filamentosi, tra cui Aspergillus spp., hanno modalità distinte di crescita e differenziazione in condizioni sub-aeree su mezzi solidi o colture sommerse. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo microscopico quantitativo per analizzare la cinetica di crescita del fungo modello Aspergillus nidulans, utilizzando l'imaging dal vivo sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Catturiamo immagini, analizziamo e quantifichiamo i tassi di crescita di diversi ceppi fungini in modo riproducibile e affidabile utilizzando un software gratuito open source per bio-immagini (ad esempio, Fiji), in un modo che non richiede alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell'utente.

Seguendo questo protocollo, abbiamo catturato e analizzato varie immagini corrispondenti a diversi stadi di crescita / sviluppo del fungo filamentoso A. nidulans. I dati presentati in questo studio sono stati elaborati e analizzati utilizzando il software Fiji. Le misurazioni sono state salvate come file csv, analizzate statisticamente e preparate come grafici utilizzando software statistici commerciali e / o linguaggio di programmazione Python utilizzando librerie software come pandas, numpy, statsmodels, matpl...

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Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Presentiamo un protocollo di imaging live senza etichette che utilizza tecniche di microscopia ottica trasmessa per catturare immagini, analizzare e quantificare la cinetica di crescita del fungo filamentoso A. nidulans sia in colture sommerse che in mezzi solidi. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con la microscopia a fluorescenza.

Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

In questo video, descriviamo un protocollo di imaging dal vivo privo di etichette per acquisire immagini del fungo modello aspergillus nidulans, utilizzando tecniche di microscopia ottica trasmessa. Usiamo queste immagini per analizzare e quantificare la cinetica di crescita di aspergillus nidulans sia in mezzi liquidi che solidi. Una rappresentazione visiva di questo protocollo consente agli utenti di acquisire familiarità con passaggi significativi di acquisizione di immagini e di elaborazione delle immagini al microscopio.Un metodo comune utilizzato per misurare la crescita fungina filamentosa è due spore fungine inoculate in una capsula di Petri contenente agar nutriente e per misurare il diametro della colonia in via di sviluppo pochi giorni dopo. Tuttavia, questo approccio non è abbastanza sensibile da quantificare le differenze di crescita fine. Pertanto, sono state sviluppate misurazioni a singola cellula utilizzando la microscopia time lapse.Queste misurazioni sono in grado non solo di fornire risultati accurati e quantitativi, ma anche di riflettere le dinamiche di crescita di diverse cellule all'interno di una popolazione. Inoltre, questo approccio mira a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nelle risposte di crescita fungina ai segnali endogeni e ambientali. Inizia versando 15 millilitri di agar nutriente liquido nelle piastre di Petri.Posizionare il coperchio sulla parte superiore e lasciarlo raffreddare. Utilizzare le radiazioni UV per sterilizzare le piastre. Prima di strisciare il ceppo fungino di interesse da un ceppo, riscaldare il cappio nodulante nel bruciatore Bunsen fino a quando non è rovente, raffreddare il cappio pugnalandolo nell'agar.Vortice del tubo e strisciare l'anello attraverso la superficie del mezzo minimo di agar integrato con le esigenze nutrizionali appropriate. Incubare le piastre per due o tre giorni a 37 gradi Celsius. Usando uno stuzzicadenti sterile, trasferire un piccolo numero di conidi toccando delicatamente una singola colonia su piastre di supporto completo.Incubare le piastre per tre o quattro giorni a 37 gradi Celsius. I conidi di aspergillus nidulans, vengono raccolti in un tubo a vortice sterile da 1,5 millilitri, con 1,0 millilitri di acqua distillata in autoclave contenente lo 0,05% di volume per volume, Tween 80, per ridurre il numero di grumi di conidi. Una versione modificata del metodo dell'agar invertito viene utilizzata per l'imaging di funghi filamentosi sulla superficie del mezzo agar.Inizialmente individuare 10 aliquote di microlitro di sospensione conidiale vigorosamente vortex, circa due volte 104 celle per millilitro su piastre di Petri di 15 millilitri minimo medio con un peso per volume di agar. Incubare la coltura sperimentale secondo lo stadio di sviluppo da indagare. Qui incubamo per tre giorni a 30 gradi Celsius.Dopo, affettare un blocco di agar contenente la colonia, usando un bisturi sterile. Qui ritagliamo un cuneo di agar al margine della colonia, invertiamo e mettiamo la fetta di agar in un otto, ben scorrevole. Trasferire 10 aliquote microlitri di sospensione conidiale vigorosamente vortex di circa due volte 10 nella potenza di quattro nei pozzetto di un vetrino contenente 200 microlitri di mezzo minimo con gli appositi integratori.Incubare per il tempo e la temperatura da esaminare ogni volta. La scelta del microscopio dipende dall'attrezzatura disponibile. In ogni caso, l'impostazione del microscopio dovrebbe includere uno stadio invertito, una camera ambientale o almeno una stanza con un controllo preciso della temperatura dell'aria.Inizialmente preriscaldare il termostato e la camera del microscopio per stabilizzare la temperatura desiderata. Qui impostiamo la temperatura a 30 gradi Celsius. Accendere il microscopio, l'alimentazione dello scanner, l'alimentazione del laser e il computer e caricare il software di imaging.Posizionare il vetrino del pozzo precedentemente preparato nella fase del microscopio e mettere a fuoco. Trova campi di vista che contengono celle isolate, non sovrapposte, o almeno non sovraffollate, per facilitare le misurazioni della crescita durante l'analisi delle immagini. Selezionare la tecnica di microscopia a luce trasmessa da utilizzare e attivare il rilevatore di luce trasmessa e i rilevatori per la fluorescenza quando necessario.Impostare il microscopio per acquisire le immagini agli intervalli di tempo desiderati e avviare l'acquisizione di serie temporali. Il caricamento, la visualizzazione e l'elaborazione delle immagini vengono eseguiti con il software open source imageJ Fiji. Inizia importando le immagini nelle Figi utilizzando i plugin di un formato.Selezionare la modalità colore predefinita e la scala automatica. Per visualizzare un timestamp e una barra di scala come sovrapposizione vai ad analizzare, strumenti, barra di scala. Impostare i parametri desiderati relativi a larghezza, altezza, colore e posizione della barra della scala.Vai a immagine, proprietà, per visualizzare le proprietà dell'immagine nel software imageJ Fiji. Osservare le informazioni sull'intervallo di fotogrammi. Qui usiamo un intervallo di tempo di circa 15 minuti e premiamo ok.Quindi vai su immagine, pile, etichetta e imposta le informazioni corrette su intervallo. Impostare la posizione dell'etichetta modificando X e Y.Impostare l'unità di misura nel testo del campo e premere anteprima. Usa la corrispondenza dell'istogramma per la correzione dell'illuminazione tra diversi fotogrammi selezionando l'immagine, la regolazione, la correzione della candeggina, la corrispondenza dell'istogramma.Viene visualizzata una nuova finestra con illuminazione corretta. Usa il plugin MtrackJ nei plugin, MtrackJ, per tenere traccia della crescente punta ifale Per aggiungere la traccia, seleziona il pulsante Aggiungi nella barra degli strumenti e posiziona il primo punto sulla punta ifale usando il tasto sinistro del mouse. La serie temporale passerà automaticamente al fotogramma successivo.Per completare il processo di tracciamento, fare doppio clic con il mouse sul punto finale o premere il tasto Esc. Lo scorrimento della tabella di output, la colonna più importante per il calcolo della crescita della punta ifale, è la velocità in un dato fotogramma. Traccia in modo sicuro le misurazioni, aggiungi file, salva con nome, nel formato di file di tua scelta, ad esempio CSV, importa il file salvato nel tuo programma di fogli di calcolo e calcola la visualizzazione e ulteriori test.Premere il pulsante del filmato per generare un filmato, tipo di colore RGB, contenente i fotogrammi con le tracce disegnate al loro dentro, che può essere visualizzato in qualsiasi lettore multimediale standard. Seguendo questo protocollo, abbiamo catturato e analizzato varie immagini corrispondenti a diversi stadi di crescita e sviluppo del fungo filamentoso aspergillus nidulans. La figura mostra il confronto tra le misurazioni del tasso di crescita wild type e azhAD Delta ngnA Delta.L'azhAD Delta ngnA Delta è un ceppo a doppia cancellazione in due geni implicati nella disintossicazione e assimilazione del prodotto da combattimento tossico L come aggiunto in due acidi carbossilici. Mostra misurazioni statisticamente significative del tasso di crescita più basso rispetto al ceppo selvatico in colture liquide sommerse. Questa differenza di crescita non è rilevabile misurando l'area della colonia di questi due ceppi in un mezzo minimo solido.L'imaging dal vivo a lunga durata a singola cellula ha un valore significativo nello sforzo di ottenere informazioni spaziali e temporali sulla dinamica delle proteine cellulari. Questo protocollo è adatto anche per l'esecuzione di immagini di cellule vive a lungo termine. Qui vediamo la germinazione dei conidi che co-esprimono la proteina eisosomiale del nucleo GFP etichettata PilA e l'istone MRFP H1. Qui in presentiamo un protocollo per analizzare la cinetica di crescita fungina in modo riproducibile e affidabile senza la necessità di alcuna precedente esperienza di analisi delle immagini da parte dell'utente.Questo protocollo consente una quantificazione oggettiva e accurata della crescita fungina.

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