Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

이 사업은 운영 프로그램 "경쟁력, 기업가 정신 및 혁신"(NSRF 2014-2020)의 자금 지원및 그리스와 EU의 공동 자금 지원을 통해 "연구 혁신 인프라 강화"(MIS)라는 "기초 생물학적 프로세스(BioImaging-GR)"(BioImaging-GR)를 시각화하고 모니터링하기 위한 그리스 연구 인프라"(MIS 5002755)의 프로젝트에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. 접종 준비
참고: 모든 단계는 라미나르 흐름 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.
<ol><li>멸균 접종 루프를 이용한 글리세롤 육수(-80°C)로부터, 최소 미디어(MM)의 플레이트에 스트레인 검사와 관련된 적절한 영양 요건으로 보충된 글리세롤 스톡(-80°C)으로부터 관심있는 곰팡이 균주를 줄무늬 [MM: 10.0g/L 포도당, 20mL/L 염용액:26g/L KCl, 26g/L KCl, 26g/L/Mg/Mg.L 76 g/L KH<s...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus,+Fusarium+and+Mucor.">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li><li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Pathogenic+Fungi:+Genomics,+Molecular+Interactions,+and+Genetic+Improvements.">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li><li>Etxebeste, O., Espeso, E. 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A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 특정 약물 치료 및/또는 유전 적 개입이 시간이 지남에 따라 검출 가능한 세포 성장 또는 표현성 차이의 결과인지 여부를 실시간으로 정량적으로 정확하게 결정하는 강력한 접근법입니다.
본 연구에서는, 신뢰할 수 있는 살아있는 세포 이미징 방법론이 A. nidulans에서세균관및 최면 팁 성...

필라멘트 균류는 큰 사회 경제적 및 생태학적 중요성, 효소 및 항생제 생산을위한 산업 / 농업 도구로 모두 중요하다1,2 및 작물 식물3의병원균으로, 해충 곤충4 및 인간3. 더욱이, 아스퍼질러스 니둘란스와 같은 필라멘트 균류는 유전학, 세포 및 진화 생물학연구뿐만 아니라 최면 연장5의연구와 같은 근본적인 연구를 위한 모델 유기체로서 널리 사용된다. 필라멘트 균류는 연장 팁6에서막 지질 /단백질의 지속적인 공급과 세포벽의 드 노보 합성을 통해 길게 하는 매우 편광 된 유기체이다. 최면 팁 성장 및 극성 유지 보수의 중심적인 역할은 주로 사이토스켈레탈 성분과 골기6,7,8의편광 분포로 구성된 고도로 정렬된 구조인 'Spitzenkorper'(SPK)라는 특수 구조이다.
환경 자극/신호, 이러한 물 공기 인터페이스, 빛,CO2 농도 및 영양 상태는 이러한 금형9에의해 이루어진 발달 결정에 대한 책임이 있다. 침수(액체) 배양에서 A. nidulans의 분화는 억압되고 성장은 최면 팁 신장6에의해 발생한다. 식물 성장 중, 무성 포자 (코니디아) 정수 확장에 의해 발아, 상호 연결된 최면 세포의 미분화 네트워크를 형성, 균사체, 영양분과 공간을 사용할 수있는 한 무기한 성장을 계속 할 수있다. 한편, 고체 미디어 최면 팁에 잔인하고 식물성장의 정의된 기간(발달 능력) 후, 무성생식이 개시되고, 공중 호디오포레 줄기는 균사체6의전문 발 세포로부터 확장된다. 이들은 유리한 환경 조건하에서 성장을 다시 시작할 수 있는 haploid conidia10의 긴 사슬을 생성하는 conidiophores에게 불린 특화된 발달 다세포 구조물을 초래합니다.
필라멘트 곰팡이 성장을 측정하는 데 널리 사용되는 방법은 페트리 접시에 함유 된 영양소 천에 포자를 접종하고 매크로로 며칠 후 식민지의 직경을 측정하는 것입니다11. 식민지의 직경/면적은 근생 성장속도의 변화에 가장 의존하고,12밀도에덜 의존하는 것으로, 성장의 가치로 사용된다. 고체 표면에서 성장하는 곰팡이 인구 (식민지) 크기를 측정하는 것은 매우 적절하지만 결코 가장 정확한 성장 척도는 아닙니다. 인구 수준 평균(곰팡이 식민지 크기의 평균)에 비해, 단일 세포 측정은 세포 집단의 이질성을 포착하고 세포의 새로운 하위 집단의 식별을 허용할 수 있으며,13,역학, 경로뿐만 아니라 세포가 내인성 및 환경 변화에 반응하는 생물학적메커니즘을 14,15. 시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 틀림없이 가장 널리 사용되는 정량적 단일 세포 관찰 접근법입니다.
본 명세서에서는, 전염된 광 현미경 기술(예: 위상 대조, 차동 간섭 대조(DIC), 편광 현미경 검사법을 사용하여 라벨없는 라이브 이미징 프로토콜을 상세히 설명하여 이미지를 캡처하는데, 이는 형광 현미경 현미경의 결합된 사용과 는 독립적으로 A. nidulans 균주의 극성 성장을 분석하고 정량화하기 위해 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

주로 최면/균주 적 성장률의 변화에 의존하는 필라멘트 균류의 식민지 성장이 식민지 크기를 비교하여 고화된 미디어에 거시적으로 추정된다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 그러나, 다른 환경/성장 조건(pH, 온도, 탄소 및 질소 원, 항생제 등)하에서 유전적으로 다른 곰팡이 균주 또는 균주의 성장 속도를 정량적으로 측정하는 것은 도전적이다. 따라서, 성장 운동학을 정량화하기 위한 보완적인 접근법의 추구는 곰팡이 세포 성장을 더 잘 이해하기 위해 필수적이다. 또한, 아스퍼질러스 스프를 포함한 필라멘트 균류는 고체 미디어 또는 침수 된 문화에 대한 공중 조건하에서 뚜렷한 성장과 차별화 모드를 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있습니다. 여기서는 침수된 배양과 고체 매체 모두에서 라이브 이미징을 사용하여 모델 균주 아스퍼질러스 니둘란스의성장 운동학을 분석하기 위한 정량적 현미경 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 사용자의 사전 이미지 분석 전문 지식을 필요로하지 않는 방식으로, 오픈 소스, 바이오 이미지 (예를 들어, 피지)에 대한 무료 소프트웨어를 사용하여 재현 가능하고 신뢰할 수있는 방식으로 다른 곰팡이 균주의 성장 속도를 캡처합니다.

이 프로토콜에 따라 필라멘트 균개 A. nidulans의다양한 성장/발달 단계에 해당하는 다양한 이미지를 캡처하고 분석했습니다. 이 연구에서 제시된 데이터는 피지 소프트웨어를 사용하여 처리되고 분석되었습니다. 측정은 판다, numpy, 통계 모델, matplotlib 및 seaborn과 같은 소프트웨어 라이브러리를 사용하여 상용 통계 소프트웨어 및 /또는 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 그래프로 통계적으로 ...

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Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.

라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

이 비디오에서는 전송된 경현미경 기술을 사용하여 모델 곰팡이 아스퍼질러스 니둘란스의 이미지를 캡처하는 라벨 무료 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액체와 고체 매체 모두에서 아스퍼 길러스 니둘란의 성장 운동학을 분석하고 정량화하기 위해이 이미지를 사용합니다. 이 프로토콜을 시각적으로 표현하면 사용자가 이미지 캡처 및 현미경 이미지 처리의 중요한 단계에 익숙해질 수 있습니다.필라멘트 곰팡이 성장을 측정하는 데 사용되는 일반적인 방법은 영양 천을 함유 한 페트리 접시에 두 개의 접종 곰팡이 포자가 며칠 후 개발 식민지의 직경을 측정하는 것입니다. 그러나, 이 방법은 미세한 성장 차이를 정량화하기에 충분히 민감하지 않습니다. 따라서 시간 경과 현미경 검사를 이용한 단일 세포 측정이 개발되었다.이 측정은 정확하고 정량적인 결과를 제공할 뿐만 아니라 인구 내의 다른 세포의 성장 역학을 반영할 수 있습니다. 더욱이, 이 접근은 내인성 및 환경 신호에 곰팡이 성장 반응에 관련시킨 분자 기계장치의 더 나은 이해를 목표로 합니다. 먼저 15밀리리터의 액체 영양사 한고를 페트리 요리에 붓는다.뚜껑을 상단에 놓고 식힙니다. UV 방사선을 사용하여 플레이트를 살균하십시오. 스톡에서 관심의 곰팡이 변형을 줄무늬하기 전에, 그것은 붉은 뜨거운 때까지 분젠 버너에서 조정 루프를 가열, 한천에 찔러 루프를 냉각.튜브를 소용돌이치며 적절한 영양 요구 사항으로 보충된 최소한의 매체의 표면을 가로질러 루프를 줄입니다. 섭씨 37도에서 2~3일 동안 플레이트를 배양합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 단일 콜로니아를 완만하게 터치하여 소수의 코니디아를 완전한 미디어 플레이트에 부드럽게 만지십시오.섭씨 37도에서 3~4일 동안 플레이트를 배양합니다. 아스퍼질러스 니둘란스의 코니디아는 멸균 1.5 밀리리터 소용돌이 튜브에서 수확되며, 1.0 밀리리터의 오토클레이브 증류수는 부피당 0.05%의 부피를 함유하고 있으며, 트위엔 80은 콘니디아 덩어리의 수를 줄입니다. 반전 된 천 방법의 수정 된 버전은 천 중간 표면에 필라멘트 곰팡이를 이미징하는 데 사용됩니다.처음에는 10 개의 마이크로 리터 알리쿼트(10개의 미세리터 알리쿼트)가 활발하게 소용돌이 를 피력으로 유지하며, 밀리리터당 약 2배 104개의 세포가 페트리 접시에 15밀리리터 의 최소 배지에 15밀리리터의 10개의 무게로 한 개의 무게를 가진 알수 있습니다. 조사할 개발 단계에 따라 실험 문화를 배양한다. 여기서 우리는 섭씨 30도에서 3 일 동안 배양합니다.그 후, 멸균 메스를 사용하여 식민지를 함유한 한천 블록을 슬라이스한다. 여기서 우리는 식민지 마진에서 한천의 쐐기를 자르고 반전하고 한천 조각을 8 개의 잘 슬라이드로 놓습니다. 10 마이크로 리터 알리쿼트의 활발한 소용돌이 원전 현탁액은 적절한 보충제로 최소 배지 200 마이크로리터를 함유하는 웰 슬라이드의 우물에서 4개의 힘으로 약 2배 10의 힘으로 진행한다.매번 검사할 시간과 온도를 위한 인큐베이션. 현미경의 선택은 사용 가능한 장비에 따라 달라집니다. 어쨌든, 설정된 현미경에는 반전 된 단계, 환경 챔버 또는 적어도 정밀한 공기 온도 제어가있는 방이 포함되어야합니다.처음에 온도 조절기와 현미경 챔버를 예열하여 원하는 온도를 안정화시합니다. 여기서 우리는 섭씨 30도에서 온도를 설정합니다. 현미경, 스캐너 전원, 레이저 전원 및 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 로드합니다.현미경 단계와 초점에 이전에 준비 된 잘 슬라이드를 배치합니다. 이미지 분석 중에 성장 측정을 용이하게 하기 위해 중복되는 셀이 아닌 격리된 셀또는 적어도 혼잡하지 않은 뷰 필드를 찾아보십시오. 필요한 경우 형광 검출기뿐만 아니라 전송된 광 검출기뿐만 아니라 활성화할 전송된 광 현미경 법을 선택하십시오.현미경을 설정하여 원하는 시간 간격으로 이미지를 획득하고 타임시리즈 수집을 시작합니다. 이미지의 로딩, 시각화 및 처리는 오픈 소스 이미지J 피지 소프트웨어로 수행됩니다. 형식으로 플러그인을 사용하여 피지에 이미지를 가져 오게하여 시작합니다.기본 색상 모드와 자동 축척을 선택합니다. 오버레이가 분석, 도구, 스케일 바를 이동함에 따라 타임스탬프와 스케일 바를 시각화하기 위해. 배율 막대의 너비, 높이, 색상 및 위치에 대해 원하는 매개변수를 설정합니다.imageJ 피지 소프트웨어에 이미지 속성을 표시하려면 이미지, 속성으로 이동합니다. 프레임 간격 정보를 관찰합니다. 여기서 우리는 약 15 분의 시간 간격을 사용하고 괜찮습니다 누릅니다.그런 다음 이미지, 스택, 레이블로 이동하여 올바른 정보를 간격으로 설정합니다. X를 수정하여 레이블의 위치를 설정하고 Y.는 필드 텍스트에서 측정 장치를 설정하고 미리 보기를 누릅니다. 히스토그램 매칭을 사용하여 이미지, 조정, 표백제 보정, 히스토그램 매칭을 선택하여 서로 다른 프레임 간의 조명 보정을 사용하십시오.수정된 조명이 있는 새 창이 나타납니다. 플러그인에서 MtrackJ 플러그인을 사용, MtrackJ, 성장 하이픈 팁을 추적하려면 트랙을 추가, 도구 모음에 추가 버튼을 선택하고 마우스의 왼쪽 클릭을 사용하여 최면 팁에 첫 번째 지점을 배치. 타임 시리즈는 자동으로 다음 프레임으로 이동합니다.추적 프로세스를 완료하려면 마지막 지점에서 마우스를 두 번 클릭하거나 이스케이프 키를 누릅니다. 최면 팁 증가를 계산하기 위한 가장 중요한 열인 출력 테이블을 스크롤하는 것은 지정된 프레임의 속도입니다. 안전 트랙 측정, 파일을 추가, 저장, 당신의 선택의 파일 형식에, 예를 들어, CSV, 스프레드 시트 프로그램에 저장된 파일을 가져 와서 시각화 및 추가 테스트를 계산합니다.영화 버튼을 눌러 모든 표준 멀티미디어 플레이어에서 시각화할 수 있는 트랙이 그려진 프레임이 포함된 RGB 컬러 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에 따라 필라멘트 균구 아스퍼질러스 니둘란스의 다양한 성장 및 발달 단계에 해당하는 다양한 이미지를 캡처하고 분석했습니다. 그림은 야생 유형 과 azhAD 델타 ngnA 델타 성장률 측정의 비교를 보여줍니다.azhAD 델타 ngnA 델타는 두 개의 카복실산에 첨가된 독성 전투기 제품 L의 해독 및 동화에 연루된 두 개의 유전자에서 이중 삭제 변형입니다. 그것은 침수 액체 배양에서 야생 형 변형에 비해 통계적으로 유의낮은 성장 속도 측정을 보여줍니다. 성장의 이 차이는 고체 최소 배지에서 이 두 균주의 식민지 영역을 측정함으로써 검출할 수 없다.단일 세포, 장기 라이브 이미징은 세포 단백질 역학의 공간 및 측두적인 정보를 얻기 위한 노력의 중요한 가치입니다. 이 프로토콜은 장기 살아있는 세포 이미징을 수행하기에도 적합합니다. 여기서 우리는 GFP 표지 코어 eisosomal 단백질 PilA 및 mRFP 히스토넨 H1을 공동 표현하는 conidia의 발아를 봅트합니다. 여기에서는 사용자로부터 이전의 이미지 분석 경험이 필요 없이 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방식으로 곰팡이 성장 운동학을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.이 프로토콜은 곰팡이 성장의 객관적인 정확한 정량화를 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

연구

생물학

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용<em&gt; 운송에 필요한 정보 미국 교통부</em&gt; 성장 콘

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...