Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av prosjektet "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) som er implementert under aksjonen "Forsterkning av forsknings- og innovasjonsinfrastrukturen", finansiert av det operative programmet "Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation" (NSRF 2014-2020) og medfinansiert av Hellas og E. U.

1. Inoculum forberedelse
MERK: Alle trinn skal utføres under et laminært strømningsskap.
<ol><li>Strekk ut soppstamme av interesse, fra et glyserollager (-80 °C) ved hjelp av en steril inokulasjonssløyfe, på plater av minimalt medium (MM) supplert med de riktige ernæringskravene som er relevante for belastningen undersøkt [MM: 10,0 g / L glukose, 20 ml / l saltoppløsning (saltoppløsning: 26 g / L KCl, 26 g / L MgSO4·7H, O2 76 g/L KH2PO4...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus,+Fusarium+and+Mucor.">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li><li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Pathogenic+Fungi:+Genomics,+Molecular+Interactions,+and+Genetic+Improvements.">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li><li>Etxebeste, O., Espeso, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans+in+the+post-genomic+era:+a+top-model+filamentous+fungus+for+the+study+of+signaling+and+homeostasis+mechanisms.">Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms.</a> International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).</li><li>Riquelme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Morphogenesis,+from+the+Polarized+Growth+of+Hyphae+to+Complex+Reproduction+and+Infection+Structures.">Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).</li><li>Athanasopoulos, A., Andr&#233;, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+plasma+membrane+domains.">Fungal plasma membrane domains.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2019).</li><li>Pantazopoulou, A., Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Dynamics+of+the+Aspergillus+nidulans+Golgi+during+Apical+Extension+and+Mitosis.">Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).</li><li>Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+global+gene+expression+and+secondary+metabolite+accumulation+during+light-dependent+Aspergillus+nidulans+development.">Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development.</a> Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).</li><li>Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Development+in+Aspergillus+nidulans+and+Aspergillus+fumigatus.">Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus.</a> Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).</li><li>Tomkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth:+The+petri+dish+method.">Measuring growth: The petri dish method.</a> Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).</li><li>Gifford, D. R., Schoustra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+colony+population+growth+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).</li><li>Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+live+cell+behaviour:+Traditional+label-free+and+quantitative+phase+imaging+approaches.">Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 89-95 (2017).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+microscopy+for+non-invasive+live+cell+population+monitoring.">Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring.</a> Scientific Reports. 11, (2021).</li><li>Chessel, A., Carazo Salas, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+observing+to+predicting+single-cell+structure+and+function+with+high-throughput/high-content+microscopy.">From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy.</a> Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).</li><li>Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Aspergillus+nidulans:+meiotic+progeny+for+genetic+analysis+and+strain+construction.">Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction.</a> Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).</li><li>Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi+Using+Vital+Fluorescent+Dyes+and+Confocal+Microscopy.">Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy.</a> Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).</li><li>Trinci, A. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinetic+Study+of+the+Growth+of+Aspergillus+nidulans+and+Other+Fungi.">A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi.</a> Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).</li><li>Lichius, A., Zeilinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Membrane+and+Cell+Wall+Selective+Fluorescent+Dyes+for+Live-Cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi.">Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).</li><li>Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immersion+oil+for+high-resolution+live-cell+imaging+at+37&#176;C:+optical+and+physical+characteristics.">Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37&#176;C: optical and physical characteristics.</a> Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+of+Zebrafish+Embryonic+Development.">In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development.</a> CSH protocols. 2007, (2007).</li><li>Walzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+low-cost+long-term+live-cell+imaging+platform+for+biomedical+research+and+education.">A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education.</a> Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64.">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li><li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy:+CellStar+and+the+Evaluation+Platform.">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).</li><li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

Overvåking av soppcellevekst og fenotype ved tidsforløpmikroskopi er en kraftig tilnærming for å vurdere cellulær atferd i sanntid og kvantitativt og nøyaktig avgjøre om en bestemt legemiddelbehandling og / eller genetisk intervensjon resulterer i påviselig cellevekst eller fenotypiske forskjeller over tid.
I denne studien ble en pålitelig levende celleavbildningsmetodikk beskrevet for å måle og kvantitativt analysere sopputvikling, inkludert dynamikken i bakterierør og hyphalspiss...

Filamentøse sopp er av stor sosioøkonomisk og økologisk betydning, og er både avgjørende som industrielle / landbruksverktøy for enzym- og antibiotikaproduksjon1,2 og som patogener av avlingsplanter3, skadedyrsinsekter4 og mennesker3. Videre er filamentøse sopp som Aspergillus nidulans mye brukt som modellorganismer for grunnleggende forskning, for eksempel studier i genetikk, celle- og evolusjonsbiologi samt for studiet av hyphal forlengelse5. Filamentøse sopp er svært polariserte organismer som forlenger gjennom kontinuerlig tilførsel av membranlipider / proteiner og de novosyntesen av cellevegg på forlengelsesspissen6. En sentral rolle i hyphalspissens vekst og polaritetsvedlikehold er en spesialisert struktur kalt 'Spitzenkorper' (SPK), en høyt bestilt struktur som hovedsakelig består av cytoskeletalkomponenter og polarisert distribusjon av Golgi6,7,8.
Miljøstimuli/signaler, slikt vann-luft-grensesnitt, lys, CO2-konsentrasjon og ernæringsstatus er ansvarlig for utviklingsbeslutningene som tas av disse formene9. I nedsenkede (flytende) kulturer er differensiering av A. nidulans undertrykt og veksten skjer ved hyphalspissforlengelse6. Under vegetativ vekst spiser aseksuelle sporer (conidia) ved apikal forlengelse, og danner et uavklart nettverk av sammenkoblede hyphalceller, myceliet, som kan fortsette å vokse på ubestemt tid så lenge næringsstoffer og plass er tilgjengelige. På den annen side, på faste medier hyphal tips forlenge og etter en definert periode med vegetativ vekst (utviklingskompetanse), aseksuelle reproduksjon er initiert og luft conidiophore stilker strekker seg fra spesialiserte fotceller i mycelium6. Disse gir opphav til spesialiserte utviklingsmessige multicellulære strukturer kalt conidiophores, som produserer lange kjeder av haploid conidia10 som kan starte veksten på nytt under gunstige miljøforhold.
En mye brukt metode for måling av filamentøs soppvekst er å inokulere sporer på næringsagar inneholdt i en Petri-tallerken og makroskopisk måle koloniens diameter noen dager senere11. Koloniens diameter/ område, mest avhengig av endringer i mycelial vekstrate og mindre på conidiophore tetthet12, brukes deretter som en verdi av vekst. Selv om måling av sopppopulasjon (koloni) størrelse som vokser på faste overflater er ganske tilstrekkelig, er det på ingen måte det mest nøyaktige målet på vekst. Sammenlignet med gjennomsnittet på befolkningsnivå (gjennomsnitt av soppkolonistørrelse), kan enkeltcellemålinger fange heterogeniteten til en cellepopulasjon og tillate identifisering av nye underpopulasjoner av celler, stater13, dynamikk, veier samt de biologiske mekanismene som celler reagerer på endogene og miljømessige endringer14,15. Overvåking av soppcellevekst og fenotype ved tidsforløpmikroskopi er uten tvil den mest brukte kvantitative enkeltcelleobservasjonsmetoden.
Heretter beskriver vi en etikettfri live bildebehandlingsprotokoll ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker (for eksempel fasekontrast, differensialinterferenskontrast (DIC) og polarisert mikroskopi) for å fange bilder, som uavhengig av kombinert bruk av fluorescensmikroskopi kan brukes til å analysere og kvantifisere polar vekst av A. nidulansstammer i både nedsenkede kulturer og faste medier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

Det er veletablert at kolonivekst av filamentøse sopp, for det meste avhengig av endringer i hyphae/mycelia apikal vekstrate, er makroskopisk estimert på størknede medier ved å sammenligne kolonistørrelse. Men å kvantitativt måle vekstraten for genetisk forskjellige soppstammer eller stammer under ulike miljø/ vekstforhold (pH, temperatur, karbon og nitrogenkilder, antibiotika, etc.) er utfordrende. Dermed blir jakten på komplementære tilnærminger for å kvantifisere vekstkinetikk obligatorisk for bedre å forstå soppcellevekst. Videre er det velkjent at filamentøse sopp, inkludert Aspergillus spp., har tydelige vekstmåter og differensiering under under-luftforhold på faste medier eller nedsenkede kulturer. Her beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metode for å analysere vekstkinetikken til modellsvampen Aspergillus nidulans, ved hjelp av levende avbildning i både nedsenkede kulturer og faste medier. Vi tar bilder, analyserer og kvantifiserer vekstrater av forskjellige soppstammer på en reproduserbar og pålitelig måte ved hjelp av en åpen kildekode, gratis programvare for biobilder (f.eks. Fiji), på en måte som ikke krever noen tidligere bildeanalyseekspertise fra brukeren.

Etter denne protokollen fanget og analyserte vi ulike bilder som tilsvarer forskjellige vekst / utviklingsstadier av den filamentøse soppen A. nidulans. Dataene som presenteres i denne studien ble behandlet og analysert ved hjelp av Fiji-programvaren. Målinger ble lagret som CSV-filer, statistisk analysert og utarbeidet som grafer ved hjelp av kommersiell statistisk programvare og / eller Python programmeringsspråk ved hjelp av programvarebiblioteker som pandas, numpy, statsmodels, matplotlib og sjøbåren. D...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Vi presenterer en etikettfri live bildeprotokoll ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker for å fange bilder, analysere og kvantifisere vekstkinetikken til den filamentøse soppen A. nidulans i både nedsenkede kulturer og solide medier. Denne protokollen kan brukes sammen med fluorescensmikroskopi.

Kvantitativ analyse av Aspergillus nidulans vekstrate ved hjelp av live mikroskopi og programvare med åpen kildekode

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

I denne videoen beskriver vi en etikettfri live bildeprotokoll for å ta bilder av modell sopp aspergillus nidulans, ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker. Vi bruker disse bildene til å analysere og kvantifisere vekstkinetikk av aspergillus nidulans i både flytende og faste medier. En visuell representasjon av denne protokollen gjør det mulig for brukere å bli kjent med viktige trinn i bildeopptak og mikroskopibildebehandling.En vanlig metode som brukes til å måle filamentøs soppvekst er to inokulere soppsporer i en Petri-tallerken som inneholder næringsagar og for å måle diameteren på den utviklende kolonien noen dager senere. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke følsom nok til å kvantifisere fine vekstforskjeller. Derfor ble enkeltcellemålinger ved hjelp av tidsforløpmikroskopi utviklet.Disse målingene er ikke bare i stand til å gi nøyaktige og kvantitative resultater, men også for å gjenspeile vekstdynamikken til forskjellige celler i en populasjon. Videre tar denne tilnærmingen sikte på bedre forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i soppvekstresponser på endogene og miljøsignaler. Begynn med å helle 15 milliliter flytende næringsmiddel agar i Petri retter.Sett lokket på toppen og la det avkjøles. Bruk UV-stråling til å sterilisere plater. Før du strekker ut soppstammen av interesse fra et lager, varme den nodulating sløyfen i Bunsen brenneren til den er rød varm, avkjøle løkken ved å stikke den inn i agaren.Virvel røret og strekke sløyfen over overflaten av agaren minimalt medium supplert med de riktige ernæringsmessige kravene. Inkuber plater i to til tre dager ved 37 grader Celsius. Bruk en steril tannpirker, overfør et lite antall conidia ved å berøre en enkelt koloni forsiktig til plater av komplette medier.Inkuber plater i tre til fire dager ved 37 grader Celsius. Conidia av aspergillus nidulans, høstes i et sterilt 1,5 milliliter virvelrør, med 1,0 milliliter autoklav destillert vann som inneholder 0,05% volum per volum, Tween 80, for å redusere antall conidia klumper. En modifisert versjon av den omvendte agarmetoden brukes til å avbilde filamentøse sopp på agar middels overflate.I utgangspunktet spot 10 mikroliter aliquots av kraftig virvel conidial suspensjon, ca to ganger 104 celler per milliliter på Petri retter av 15 milliliter minimal medium med en vekt per volum agar. Inkuber den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsstadiet som skal undersøkes. Her inkuberer vi i tre dager ved 30 grader Celsius.Deretter skjærer du ut en agarblokk som inneholder kolonien, ved hjelp av en steril skalpell. Her kutter vi ut en agarkile ved kolonimarginen, inverterer og legger agarskiven i en åtte, godt glidende. Overfør 10 mikroliter aliquots av kraftig virvel conidial suspensjon på ca. to ganger 10 i kraften på fire i brønnene til en brønnsklie som inneholder 200 mikroliter minimalt medium med passende kosttilskudd.Inkuber for tiden og temperaturen som skal undersøkes hver gang. Valget av mikroskop avhenger av tilgjengelig utstyr. I alle fall bør mikroskopet som er satt opp inkludere et invertert stadium, et miljøkammer eller i det minste et rom med presis lufttemperaturkontroll.Forvarm først termostaten og mikroskopkammeret for å stabilisere ønsket temperatur. Her setter vi temperaturen på 30 grader Celsius. Slå på mikroskopet, skannerens strøm, laserstrømmen og datamaskinen, og last inn bildebehandlingsprogramvaren.Plasser den tidligere forberedte brønnskuffen i mikroskopstadiet og fokuser. Finn synsfelt som inneholder isolerte celler, ikke overlappende celler, eller i det minste ikke overbefolket, for å lette vekstmålinger under bildeanalyse. Velg den overførte lysmikroskopiteknikken som skal brukes, og aktiver den overførte lysdetektoren samt detektorer for fluorescens når det er nødvendig.Angi mikroskopet for å hente bilder ved ønskede tidsintervaller og oppkjøp av starttidsserier. Lasting, visualisering og behandling av bilder oppnås med open source imageJ Fiji-programvaren. Begynn med å importere bildene til Fiji ved hjelp av plugins med et format.Velg standard fargemodus og automatisk skalering. For å visualisere et tidsstempel og en skalalinje som overlegg, gå til å analysere, verktøy, skalalinje. Angi de ønskede parameterne for bredde, høyde, farge og plassering av skalalinjen.Gå til bilde, egenskaper, for å vise bildeegenskaper i imageJ Fiji-programvare. Følg informasjon om rammeintervall. Her bruker vi et tidsintervall på ca. 15 minutter og trykker ok.Gå deretter til bilde, stabler, etikett og sett riktig informasjon til intervall. Angi plasseringen av etiketten ved å endre X og Y.Set målenheten i feltteksten og trykk forhåndsvisning. Bruk histogramsamsvar for belysningskorrigering mellom ulike rammer ved å velge bilde, justere, blekemiddelkorrigering, histogramsamsvar.Et nytt vindu med korrigert belysning vises. Bruk MtrackJ plugin på plugins, MtrackJ, for å spore voksende hyphal tips For å legge til sporet, velg legg til-knappen på verktøylinjen og plasser det første punktet på hyphalspissen ved hjelp av venstre museklikk. Tidsserien flyttes automatisk til neste bilde.Hvis du vil fullføre sporingsprosessen, dobbeltklikker du musen på det siste punktet eller trykker ESC. Rulling av utdatatabellen, den viktigste kolonnen for beregning av hyphalspissvekst, er hastigheten på en gitt ramme. Sikre spormålinger, legg til fil, lagre som, i filformatet du ønsker, for eksempel CSV, importer den lagrede filen til regnearkprogrammet ditt og beregn visualiseringen og ytterligere tester.Trykk på filmknappen for å generere en film, RGB-fargetype, som inneholder rammene med sporene trukket inn i dem, som kan visualiseres i en hvilken som helst standard multimediespiller. Etter denne protokollen fanget og analyserte vi ulike bilder som tilsvarer forskjellige vekst- og utviklingsstadier av den filamentøse soppen aspergillus nidulans. Figur viser sammenligningen av vill type og azhAD Delta ngnA Delta vekstratemålinger.AzhAD Delta ngnA Delta er en dobbelt slettet stamme i to gener implisert i avgiftning og assimilering av det giftige fighterproduktet L som tilsatt i to karboksylsyre. Den viser statistisk signifikante lavere vekstratemålinger sammenlignet med den ville typen belastning i nedsenkede flytende kulturer. Denne forskjellen i vekst kan ikke påvises ved å måle koloniområdet til disse to stammene i solid minimalt medium.Enkeltcellet, langsiktig levende avbildning er av betydelig verdi i arbeidet med å oppnå spasiell og tidsmessig informasjon om cellulær proteindynamikk. Denne protokollen er også egnet for å utføre langsiktig levende celleavbildning. Her ser vi spiring av conidia co-uttrykke GFP merket kjerne eisosomal protein PilA og mRFP histonen H1. Her presenterer vi en protokoll for å analysere soppvekstkinetikk på en reproduserbar og pålitelig måte uten behov for noen tidligere bildeanalyseerfaring fra brukeren.Denne protokollen tillater objektiv nøyaktig kvantifisering av soppvekst.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbeidsflyt for High-innhold, Individuell Cell Kvantifisering av Fluorescent Markers fra Universal Microscope data, som støttes av Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Bruke plusTipTracker Programvare to Measure mikrotubulidynamikk i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; vekst kjegler

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og Kvantifisering utviklingsprosesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Ved hjelp av Open-source verktøy

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Høy innholdsanalyse Utnytte Automated Fluorescence Lifetime Imaging Mikros

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...