Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo projeto "Uma Infraestrutura de Pesquisa Grega para Visualização e Monitoramento de Processos Biológicos Fundamentais (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) que é implementado sob a Ação "Reforço da Infraestrutura de Pesquisa e Inovação", financiado pelo Programa Operacional "Competitividade, Empreendedorismo e Inovação" (NSRF 2014-2020) e co-financiado pela Grécia e pela E. U.

1. Preparação inóculo
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um gabinete de fluxo laminar.
<ol><li>Estirpe de interesse fúngico, a partir de um estoque de glicerol (-80 °C) utilizando um laço de inoculação estéril, em placas de mídia mínima (MM) complementadas com os requisitos nutricionais adequados relevantes para a cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glicose, solução de sal de 20 mL/L (solução de sal: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2,O 76 g/L KH...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. 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A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64.">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li><li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy:+CellStar+and+the+Evaluation+Platform.">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).</li><li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. 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S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é uma abordagem poderosa para avaliar o comportamento celular em tempo real e quantitativamente e com precisão e determinar com precisão se um tratamento medicamentoso específico e/ou intervenção genética resulta em crescimento celular detectável ou diferenças fenotípicas ao longo do tempo.
Neste estudo, foi descrita uma metodologia confiável de imagem de células vivas para medir e analis...

Os fungos filamentosos são de grande importância socioeconômica e ecológica, sendo tanto cruciais quanto ferramentas industriais/agrícolas para a produção de enzimas e antibióticos1,2 e como patógenos de plantas agrícolas3, insetos depragas 4 e humanos3. Além disso, fungos filamentosos como os nidulans Aspergillus são amplamente utilizados como organismos-modelo para pesquisas fundamentais, como estudos em genética, biologia celular e evolutiva, bem como para o estudo da extensão hifal5. Fungos filamentosos são organismos altamente polarizados que alongam o fornecimento contínuo de lipídios/proteínas de membrana e a nova síntese da parede celular na ponta de extensão6. Um papel central no crescimento da ponta hífa e na manutenção da polaridade é uma estrutura especializada chamada 'Spitzenkorper' (SPK), uma estrutura altamente ordenada composta principalmente por componentes citoesqueléticos e distribuição polarizada do Golgi6,7,8.
Estímulos/sinais ambientais, tais interface água-ar, luz, concentração de CO2 e o estado nutricional são responsáveis pelas decisões de desenvolvimento tomadas por esses moldes9. Nas culturas submersas (líquidas) a diferenciação de A. nidulans é reprimida e o crescimento ocorre por alongamento da ponta hiphal6. Durante o crescimento vegetativo, esporos assexuados (conidia) germinam por extensão apical, formando uma rede indiferenciada de células hifamais interconectadas, o micélio, que pode continuar a crescer indefinidamente enquanto nutrientes e espaço estiverem disponíveis. Por outro lado, em pontas higiféricas de mídia sólida alongam e após um período definido de crescimento vegetativo (competência do desenvolvimento), inicia-se a reprodução assexual e os talos de conidiophore aéreo se estendem das células especializadas do pé domicélio 6. Estes dão origem a estruturas multicelulares especializadas de desenvolvimento chamadas conidioforos, que produzem longas cadeias de conidia10 haploide que podem reiniciar o crescimento em condições ambientais favoráveis.
Um método amplamente utilizado para medir o crescimento fúngico filamentoso é inocular esporos em ágar nutrientes contidos em uma placa de Petri e medir macroscopicamente o diâmetro da colônia alguns diasdepois 11. O diâmetro/área da colônia, mais dependente de mudanças na taxa de crescimento micelial e menos na densidade conidiophore12,é então usado como um valor de crescimento. Embora, medir o tamanho da população fúngica (colônia) crescendo em superfícies sólidas seja bastante adequado, não é de forma alguma a medida mais precisa de crescimento. Em comparação com as médias populacionais (médias do tamanho da colônia fúngica), as medições de células únicas podem capturar a heterogeneidade de uma população celular e permitir a identificação de novas subsédias de células, afirma13, dinâmicas, caminhos, bem como os mecanismos biológicos pelos quais as células respondem a mudanças endógenas e ambientais14,15. Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é, sem dúvida, a abordagem de observação de células únicas quantitativas mais amplamente empregadas.
Aqui, detalhamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia polarizada) para capturar imagens, que independentemente do uso combinado de microscopia de fluorescência podem ser empregadas para analisar e quantificar o crescimento polar de cepas de A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

Está bem estabelecido que o crescimento de fungos filamentosos, principalmente dependentes de mudanças na taxa de crescimento hifa/micáceico, é macroscopicamente estimado em mídia solidificada comparando o tamanho da colônia. No entanto, medir quantitativamente a taxa de crescimento de cepas ou cepas fúngicas geneticamente diferentes sob diferentes condições ambientais/de crescimento (pH, temperatura, fontes de carbono e nitrogênio, antibióticos, etc.) é um desafio. Assim, a busca de abordagens complementares para quantificar a cinética do crescimento torna-se obrigatória para entender melhor o crescimento das células fúngicas. Além disso, é sabido que fungos filamentosos, incluindo aspergillus spp., possuem modos distintos de crescimento e diferenciação sob condições sub-aéreas em mídia sólida ou culturas submersas. Aqui, detalhamos um método microscópico quantitativo para analisar a cinética de crescimento do fungo modelo Aspergillus nidulans, utilizando imagens vivas em culturas submersas e mídia sólida. Capturamos imagens, analisamos e quantificamos as taxas de crescimento de diferentes cepas fúngicas de forma reprodutível e confiável usando um software livre de código aberto para bioimagens (por exemplo, Fiji), de uma forma que não exija qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.

Seguindo este protocolo, capturamos e analisamos várias imagens correspondentes a diferentes estágios de crescimento/desenvolvimento do fungo filamentoso A. nidulans. Os dados apresentados neste estudo foram processados e analisados utilizando-se o software Fiji. As medições foram salvas como arquivos csv, estatisticamente analisadas e preparadas como gráficos usando software estatístico comercial e/ou linguagem de programação Python usando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsmodels, matplot...

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Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Neste vídeo, descrevemos um protocolo de imagem ao vivo gratuito para capturar imagens do modelo fungo aspergillus nidulans, usando técnicas de microscopia de luz transmitida. Usamos essas imagens para analisar e quantificar a cinética de crescimento de aspergillus nidulans em mídia líquida e sólida. Uma representação visual deste protocolo permite que os usuários se familiarizem com etapas significativas de captura de imagens e processamento de imagens de microscopia.Um método comum usado para medir o crescimento fúngico filamentoso são dois esporos fúngicos inoculados em uma placa de Petri contendo ágar nutriente e para medir o diâmetro da colônia em desenvolvimento alguns dias depois. No entanto, essa abordagem não é sensível o suficiente para quantificar as diferenças de crescimento. Por isso, foram desenvolvidas medições de células únicas utilizando microscopia de lapso de tempo.Essas medidas são capazes não apenas de fornecer resultados precisos e quantitativos, mas também de refletir a dinâmica de crescimento de diferentes células dentro de uma população. Além disso, essa abordagem visa compreender melhor os mecanismos moleculares envolvidos nas respostas de crescimento fúngico aos sinais endógenos e ambientais. Comece por despejar 15 mililitros de ágar de nutrientes líquidos em pratos petri.Coloque a tampa na parte superior e deixe esfriar. Use radiação UV para esterilizar placas. Antes de escarar a tensão fúngica de interesse de um estoque, aqueça o laço nodulante no queimador de Bunsen até que esteja quente, esfrie o laço esfaqueando-o no ágar.Vórtice do tubo e listrar o laço através da superfície do ágar meio mínimo complementado com as necessidades nutricionais adequadas. Incubar placas por dois a três dias a 37 graus Celsius. Usando um palito estéril, transfira um pequeno número de conidia tocando suavemente uma única colônia para placas de mídia completa.Incubar placas por três a quatro dias a 37 graus Celsius. Conidia de aspergillus nidulans, são colhidas em um tubo de vórtice estéril de 1,5 mililitro, com 1,0 mililitro de água autoclave destilada contendo 0,05% de volume por volume, Tween 80, para reduzir o número de aglomerados de conidia. Uma versão modificada do método ágar invertido é usada para imagens de fungos filamentosos na superfície média do ágar.Inicialmente localmente 10 alíquotas de microliter de suspensão conidial vigorosamente vórtice, aproximadamente duas vezes 104 células por mililitro em placas de Petri de 15 mililitros médio mínimo com um peso por ágar de volume. Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento a ser investigado. Aqui incubamos por três dias a 30 graus Celsius.Depois, corte um bloco de ágar contendo a colônia, usando um bisturi estéril. Aqui nós cortamos uma cunha de ágar na margem da colônia, invertemos e colocamos a fatia de ágar em um oito, bem slide. Transfira 10 alíquotas de microliter de suspensão conidial vigorosamente vórtice de aproximadamente duas vezes 10 na potência de quatro nos poços de um slide de poço contendo 200 microliters de meio mínimo com os suplementos apropriados.Incubar para que o tempo e a temperatura sejam examinados cada vez. A escolha do microscópio depende do equipamento disponível. De qualquer forma, o microscópio configurado deve incluir um estágio invertido, uma câmara ambiental ou pelo menos uma sala com controle preciso da temperatura do ar.Inicialmente pré-aqueça o termostato e a câmara de microscópio para estabilizar a temperatura desejada. Aqui nós definimos a temperatura em 30 graus Celsius. Ligue o microscópio, a potência do scanner, a potência do laser e o computador, e carregue o software de imagem.Coloque o slide previamente preparado no estágio do microscópio e foco. Encontre campos de visão que contenham células isoladas, não sobrepostas, ou pelo menos não superlotadas, para facilitar as medições de crescimento durante a análise da imagem. Selecione a técnica de microscopia de luz transmitida a ser usada e ative o detector de luz transmitido, bem como detectores para fluorescência quando necessário.Defina o microscópio para adquirir imagens nos intervalos de tempo desejados e iniciar a aquisição da série temporal. O carregamento, visualização e processamento de imagens é realizado com o software de imagem de código abertoJ Fiji. Comece importando as imagens para Fiji usando plugins por um formato.Selecione o modo de cor padrão e a escala automática. A fim de visualizar um carimbo de tempo e uma barra de escala como sobreposição vá para análise, ferramentas, barra de escala. Defina os parâmetros desejados em relação à largura, altura, cor e localização da barra de escala.Vá para imagem, propriedades, para exibir propriedades de imagem no software imageJ Fiji. Observe as informações do intervalo do quadro. Aqui usamos um intervalo de tempo de aproximadamente 15 minutos e pressionamos bem.Em seguida, vá para imagem, pilhas, rotular e definir as informações corretas para o intervalo. Defina a localização do rótulo modificando X e Y.Defina a unidade de medição no texto de campo e pressione a visualização. Use a correspondência de histograma para correção de iluminação entre diferentes quadros, selecionando imagem, ajuste, correção de alvejante, correspondência de histograma.Uma nova janela com iluminação corrigida aparece. Use o plugin MtrackJ em plugins, MtrackJ, para rastrear a ponta hignótica em crescimento Para adicionar a faixa, selecione o botão adicionar na barra de ferramentas e coloque o primeiro ponto na ponta hifana usando o clique esquerdo do mouse. A série de tempo passará automaticamente para o próximo quadro.Para concluir o processo de rastreamento, clique duas vezes no mouse no ponto final ou pressione a tecla escape. Rolar a tabela de saída, a coluna mais importante para calcular o crescimento da ponta hignágica, é a velocidade em qualquer quadro. Medições seguras de faixa, adicionar arquivo, salvar como, ao formato de arquivo de sua escolha, por exemplo, CSV, importar o arquivo salvo em seu programa de planilha e calcular a visualização e outros testes.Pressione o botão de filme para gerar um filme, tipo de cor RGB, contendo os quadros com as faixas desenhadas neles, que podem ser visualizados em qualquer reprodutor multimídia padrão. Seguindo este protocolo, capturamos e analisamos várias imagens correspondentes a diferentes estágios de crescimento e desenvolvimento do fungo filamentoso aspergillus nidulans. A figura mostra a comparação das medições de taxa de crescimento do Delta ngnA Delta da AzhAD Delta.O delta ngnA Delta azhAD é uma cepa duplamente excluída em dois genes implicados na desintoxicação e assimilação do produto de caça tóxico L, como adicionado em dois ácidos carboxílicos. Mostra medidas estatisticamente significativas de menor taxa de crescimento em comparação com a cepa do tipo selvagem em culturas líquidas submersas. Essa diferença de crescimento não é detectável medindo a área da colônia dessas duas cepas em meio mínimo sólido.A imagem viva de célula única e de longo prazo é de valor significativo no esforço para obter informações espaçais e temporais da dinâmica das proteínas celulares. Este protocolo também é adequado para a realização de imagens de células vivas de longo prazo. Aqui vemos a germinação da conidia co-expressando a proteína eisosômica do núcleo da GFP PilA e o mRFP histonen H1. Aqui apresentamos um protocolo para analisar cinética de crescimento fúngico de forma reprodutível e confiável sem a necessidade de qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.Este protocolo permite quantificação objetiva e precisa do crescimento fúngico.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

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Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

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Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

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Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

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Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

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Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

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