Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) que se implementa en el marco de la Acción "Refuerzo de la Infraestructura de Investigación e Innovación", financiado por el Programa Operativo "Competitividad, Emprendimiento e Innovación" (NSRF 2014-2020) y cofinanciado por Grecia y la UE.

1. Preparación del inóculo
NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.
<ol><li>Extraer la cepa fúngica de interés, de una cepa de glicerol (-80 °C) utilizando un bucle de inoculación estéril, en placas de medios mínimos (MM) complementadas con los requisitos nutricionales apropiados relevantes para la cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glucosa, 20 ml/L de solución salina (solución salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH<su...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. 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A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. 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S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es un enfoque poderoso para evaluar el comportamiento celular en tiempo real y determinar cuantitativa y precisamente si un tratamiento farmacológico en particular y / o intervención genética da como resultado un crecimiento celular detectable o diferencias fenotípicas a lo largo del tiempo.
En este estudio, se describió una metodología confiable de imágenes de células vivas para medir y a...

Los hongos filamentosos son de gran importancia socioeconómica y ecológica, siendo tanto cruciales como herramientas industriales/agrícolas para la producción de enzimas y antibióticos1,2 y como patógenos de plantas de cultivo3,insectos plaga4 y humanos3. Además, los hongos filamentosos como Aspergillus nidulans son ampliamente utilizados como organismos modelo para la investigación fundamental, como los estudios en genética, biología celular y evolutiva, así como para el estudio de la extensión hifal5. Los hongos filamentosos son organismos altamente polarizados que se alargan a través del suministro continuo de lípidos/proteínas de membrana y la síntesis de novo de la pared celular en la punta extensible6. Un papel central en el crecimiento de la punta hifal y el mantenimiento de la polaridad es una estructura especializada llamada 'Spitzenkorper' (SPK), una estructura altamente ordenada que consiste principalmente en componentes citoesqueléticos y la distribución polarizada de los6,7,8de Golgi.
Los estímulos/señales ambientales, como la interfaz agua-aire, la luz, la concentración de CO2 y el estado nutricional son responsables de las decisiones de desarrollo tomadas por estos mohos9. En cultivos sumergidos (líquidos) se reprime la diferenciación de A. nidulans y se produce el crecimiento por elongación de la punta hifal6. Durante el crecimiento vegetativo, las esporas asexuales (conidios) germinan por extensión apical, formando una red indiferenciada de células hifales interconectadas, el micelio, que pueden continuar creciendo indefinidamente mientras los nutrientes y el espacio estén disponibles. Por otro lado, en las puntas hifales de medios sólidos alargadas y después de un período definido de crecimiento vegetativo (competencia del desarrollo), se inicia la reproducción asexual y los tallos de conidióforos aéreos se extienden desde las células especializadas del pie del micelio6. Estos dan lugar a estructuras multicelulares de desarrollo especializadas llamadas conidióforos, que producen largas cadenas de conidios haploides10 que pueden reiniciar el crecimiento en condiciones ambientales favorables.
Un método ampliamente utilizado para medir el crecimiento de hongos filamentosos es inocular esporas en agar nutriente contenido en una placa de Petri y medir macroscópicamente el diámetro de la colonia unos días después11. El diámetro/área de la colonia, más dependiente de los cambios en la tasa de crecimiento micelial y menos de la densidad del conidióforo12,se utiliza entonces como valor de crecimiento. Aunque, medir el tamaño de la población fúngica (colonia) que crece en superficies sólidas es bastante adecuado, de ninguna manera es la medida más precisa del crecimiento. En comparación con los promedios a nivel poblacional (promedios del tamaño de las colonias de hongos), las mediciones de una sola célula pueden capturar la heterogeneidad de una población celular y permitir la identificación de nuevas subpoblaciones de células, estados13,dinámicas, vías, así como los mecanismos biológicos por los cuales las células responden a los cambios endógenos y ambientales14,15. El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es posiblemente el enfoque cuantitativo de observación de células individuales más ampliamente empleado.
A continuación, detallamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía polarizada) para capturar imágenes, que independientemente del uso combinado de microscopía de fluorescencia se puede emplear para analizar y cuantificar el crecimiento polar de cepas de A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

Está bien establecido que el crecimiento de colonias de hongos filamentosos, en su mayoría dependiente de cambios en la tasa de crecimiento apical de hifas/micelios, se estima macroscópicamente en medios solidificados comparando el tamaño de la colonia. Sin embargo, medir cuantitativamente la tasa de crecimiento de cepas o cepas de hongos genéticamente diferentes bajo diferentes condiciones ambientales / de crecimiento (pH, temperatura, fuentes de carbono y nitrógeno, antibióticos, etc.) es un desafío. Por lo tanto, la búsqueda de enfoques complementarios para cuantificar la cinética del crecimiento se vuelve obligatoria para comprender mejor el crecimiento de células fúngicas. Además, es bien sabido que los hongos filamentosos, incluido Aspergillus spp., tienen distintos modos de crecimiento y diferenciación en condiciones subaésperas en medios sólidos o cultivos sumergidos. Aquí, detallamos un método microscópico cuantitativo para analizar la cinética de crecimiento del hongo modelo Aspergillus nidulans,utilizando imágenes en vivo tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Capturamos imágenes, analizamos y cuantificamos las tasas de crecimiento de diferentes cepas de hongos de una manera reproducible y confiable utilizando un software libre de código abierto para bio-imágenes (por ejemplo, Fiji), de una manera que no requiere ninguna experiencia previa en análisis de imágenes por parte del usuario.

Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento/desarrollo del hongo filamentoso A. nidulans. Los datos presentados en este estudio se procesaron y analizaron utilizando el software de Fiji. Las mediciones se guardaron como archivos csv, se analizaron estadísticamente y se prepararon como gráficos utilizando software estadístico comercial y / o lenguaje de programación Python utilizando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsm...

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Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.

Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

En este video, describimos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas para capturar imágenes del hongo modelo aspergillus nidulans, utilizando técnicas de microscopía de luz transmitida. Utilizamos estas imágenes para analizar y cuantificar la cinética de crecimiento de aspergillus nidulans en medios líquidos y sólidos. Una representación visual de este protocolo permite a los usuarios familiarizarse con los pasos significativos de la captura de imágenes y el procesamiento de imágenes de microscopía.Un método común utilizado para medir el crecimiento de hongos filamentosos son dos esporas de hongos inoculados en una placa de Petri que contiene agar nutriente y para medir el diámetro de la colonia en desarrollo unos días después. Sin embargo, este enfoque no es lo suficientemente sensible como para cuantificar las diferencias finas de crecimiento. Por lo tanto, se desarrollaron mediciones de una sola célula utilizando microscopía de lapso de tiempo.Estas mediciones son capaces no solo de proporcionar resultados precisos y cuantitativos, sino también de reflejar la dinámica de crecimiento de diferentes células dentro de una población. Además, este enfoque tiene como objetivo comprender mejor los mecanismos moleculares involucrados en las respuestas de crecimiento de hongos a las señales endógenas y ambientales. Comience vertiendo 15 mililitros de agar nutriente líquido en placas de Petri.Coloque la tapa en la parte superior y deje que se enfríe. Use radiación UV para esterilizar placas. Antes de eliminar la cepa fúngica de interés de una cepa, caliente el bucle ondulante en el quemador Bunsen hasta que esté al rojo vivo, enfríe el bucle apuñalándolo en el agar.Vórtice el tubo y raye el bucle a través de la superficie del medio mínimo de agar suplementado con los requisitos nutricionales apropiados. Incubar placas durante dos o tres días a 37 grados centígrados. Usando un palillo de dientes estéril, transfiera un pequeño número de conidios tocando suavemente una sola colonia a placas de medios completos.Incubar placas durante tres o cuatro días a 37 grados centígrados. Los conidios de aspergillus nidulans, se cosechan en un tubo de vórtice estéril de 1,5 mililitros, con 1,0 mililitros de agua destilada en autoclave que contiene 0,05% de volumen por volumen, Tween 80, para reducir el número de grupos de conidios. Una versión modificada del método del agar invertido se utiliza para obtener imágenes de hongos filamentosos en la superficie media del agar.Inicialmente detectar 10 alícuotas de microlitros de suspensión conidial vigorosamente vórtice, aproximadamente dos veces 104 células por mililitro en placas de Petri de 15 mililitros de medio mínimo con un peso por volumen de agar. Incubar el cultivo experimental de acuerdo a la etapa de desarrollo a investigar. Aquí incubamos durante tres días a 30 grados centígrados.Después, corte un bloque de agar que contenga la colonia, usando un bisturí estéril. Aquí cortamos una cuña de agar en el margen de la colonia, invertimos y colocamos la rodaja de agar en un ocho, bien deslizable. Transfiera 10 alícuotas de microlitros de suspensión conidial vigorosamente vórtice de aproximadamente dos veces 10 en la potencia de cuatro en los pozos de un portaobjetos de pozo que contenga 200 microlitros de medio mínimo con los suplementos apropiados.Incubar durante el tiempo y la temperatura a examinar cada vez. La elección del microscopio depende del equipo disponible. En cualquier caso, la configuración del microscopio debe incluir una etapa invertida, una cámara ambiental o al menos una habitación con un control preciso de la temperatura del aire.Inicialmente precaliente el termostato y la cámara del microscopio para estabilizar la temperatura deseada. Aquí fijamos la temperatura en 30 grados centígrados. Encienda el microscopio, la potencia del escáner, la alimentación del láser y la computadora, y cargue el software de imágenes.Coloque el portaobjetos de pozo previamente preparado en la etapa de microscopio y enfoque. Encuentre campos de visión que contengan celdas aisladas, no superpuestas, o al menos no superpobladas, para facilitar las mediciones de crecimiento durante el análisis de imágenes. Seleccione la técnica de microscopía de luz transmitida que se utilizará y active el detector de luz transmitida, así como los detectores de fluorescencia cuando sea necesario.Configure el microscopio para adquirir imágenes a los intervalos de tiempo deseados e iniciar la adquisición de series temporales. La carga, visualización y procesamiento de imágenes se realiza con el software de código abierto imageJ Fiji. Comience importando las imágenes a Fiji usando plugins por un formato.Seleccione el modo de color predeterminado y la escala automática. Para visualizar una marca de tiempo y una barra de escala como superposición vaya a analizar, herramientas, barra de escala. Establezca los parámetros deseados con respecto al ancho, la altura, el color y la ubicación de la barra de escala.Vaya a imagen, propiedades, para mostrar las propiedades de imagen en el software imageJ Fiji. Observe la información del intervalo de fotogramas. Aquí usamos un intervalo de tiempo de aproximadamente 15 minutos y presionamos OK.Luego vaya a la imagen, las pilas, la etiqueta y establezca la información correcta en intervalo. Establezca la ubicación de la etiqueta modificando X e Y.Establezca la unidad de medida en el texto del campo y presione vista previa. Utilice la coincidencia de histogramas para la corrección de iluminación entre diferentes fotogramas seleccionando imagen, ajuste, corrección de blanqueamiento, coincidencia de histogramas.Aparece una nueva ventana con iluminación corregida. Use el complemento MtrackJ en los complementos, MtrackJ, para rastrear la punta hifal creciente Para agregar la pista, seleccione el botón agregar en la barra de herramientas y coloque el primer punto en la punta hifal con el clic izquierdo del mouse. La serie temporal se moverá automáticamente al siguiente fotograma.Para completar el proceso de seguimiento, haga doble clic con el mouse en el punto final o presione la tecla de escape. Desplazarse por la tabla de salida, la columna más importante para calcular el crecimiento de la punta hifal, es la velocidad en cualquier fotograma dado. Realice un seguimiento seguro de las mediciones, agregue el archivo, guarde como, al formato de archivo de su elección, por ejemplo, CSV, importe el archivo guardado en su programa de hoja de cálculo y calcule la visualización y otras pruebas.Presione el botón de película para generar una película, tipo de color RGB, que contenga los fotogramas con las pistas dibujadas en ellos, que se puede visualizar en cualquier reproductor multimedia estándar. Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento y desarrollo del hongo filamentoso aspergillus nidulans. La figura muestra la comparación de las mediciones de la tasa de crecimiento del tipo salvaje y azhAD Delta ngnA Delta.La azhAD Delta ngnA Delta es una cepa doblemente eliminada en dos genes implicados en la desintoxicación y asimilación del producto combatiente tóxico L añadido en dos ácidos carboxílicos. Muestra mediciones estadísticamente significativas de menor tasa de crecimiento en comparación con la cepa de tipo salvaje en cultivos líquidos sumergidos. Esta diferencia en el crecimiento no es detectable midiendo el área de colonia de estas dos cepas en medio mínimo sólido.Las imágenes en vivo a largo plazo de una sola célula son de gran valor en el esfuerzo por obtener información espacial y temporal de la dinámica de las proteínas celulares. Este protocolo es adecuado también para llevar a cabo imágenes de células vivas a largo plazo. Aquí vemos la germinación de los conidios co-expresando la proteína eisosomal del núcleo etiquetado con GFP PilA y la histona MRFP H1. Aquí en presentamos un protocolo para analizar la cinética de crecimiento fúngico de una manera reproducible y confiable sin la necesidad de ninguna experiencia previa de análisis de imágenes por parte del usuario.Este protocolo permite una cuantificación objetiva y precisa del crecimiento de hongos.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Investigación

Biología

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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Flujo de trabajo para de alto contenido, cuantificación de la célula individual de marcadores fluorescentes de Universal Microscopio de datos, apoyados por software de fuente abierta

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

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Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

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