Name: quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software
Uploaded: 2021-07-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Bu çalışma kısmen"Rekabetçilik, Girişimcilik ve İnovasyon" (NSRF 2014-2020) Operasyonel Programı (NSRF 2014-2020) tarafından finanse edilen ve Yunanistan ve AB tarafından ortaklaşa finanse edilen "Araştırma ve yenilik Altyapısının Güçlendirilmesi" Eylemi kapsamında uygulanan "Temel Biyolojik Süreçleri Görselleştirmek ve İzlemek için Bir Yunan Araştırma Altyapısı (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) projesi tarafından desteklenmiştir.

1. Inoculum hazırlığı
NOT: Tüm adımlar laminer akış kabini altında yapılmalıdır.
<ol><li>Steril bir aşılama döngüsü kullanarak gliserol stoğundan (-80 °C) incelenen suşla ilgili uygun beslenme gereksinimleriyle desteklenmiş minimal ortam (MM) plakalarına kadar mantar suşu çıkarın [MM: 10,0 g/L glikoz, 20 mL/L tuz çözeltisi (tuz çözeltisi: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4,2,0 mL/L kloroform) ve 1 mL/L iz e...

<ol>
	<li>Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans:+A+Potential+Resource+of+the+Production+of+the+Native+and+Heterologous+Enzymes+for+Industrial+Applications.">Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications.</a> International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).</li><li>K&#252;ck, U., Bloemendal, S., Teichert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+Fungi+to+Work:+Harvesting+a+Cornucopia+of+Drugs,+Toxins,+and+Antibiotics.">Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).</li><li>Paterson, R. R. M., Lima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Fungal+Human+Pathogens+from+Food+Emphasising+Aspergillus,+Fusarium+and+Mucor.">Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor.</a> Microoraganism. 5 (3), (2017).</li><li>Wang, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+Pathogenic+Fungi:+Genomics,+Molecular+Interactions,+and+Genetic+Improvements.">Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements.</a> Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).</li><li>Etxebeste, O., Espeso, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+nidulans+in+the+post-genomic+era:+a+top-model+filamentous+fungus+for+the+study+of+signaling+and+homeostasis+mechanisms.">Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms.</a> International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).</li><li>Riquelme, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+Morphogenesis,+from+the+Polarized+Growth+of+Hyphae+to+Complex+Reproduction+and+Infection+Structures.">Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).</li><li>Athanasopoulos, A., Andr&#233;, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+plasma+membrane+domains.">Fungal plasma membrane domains.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2019).</li><li>Pantazopoulou, A., Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Dynamics+of+the+Aspergillus+nidulans+Golgi+during+Apical+Extension+and+Mitosis.">Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).</li><li>Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+global+gene+expression+and+secondary+metabolite+accumulation+during+light-dependent+Aspergillus+nidulans+development.">Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development.</a> Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).</li><li>Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Development+in+Aspergillus+nidulans+and+Aspergillus+fumigatus.">Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus.</a> Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).</li><li>Tomkins, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth:+The+petri+dish+method.">Measuring growth: The petri dish method.</a> Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).</li><li>Gifford, D. R., Schoustra, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+colony+population+growth+in+the+filamentous+fungus+Aspergillus+nidulans.">Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans.</a> Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).</li><li>Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+live+cell+behaviour:+Traditional+label-free+and+quantitative+phase+imaging+approaches.">Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 84, 89-95 (2017).</li><li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+microscopy+for+non-invasive+live+cell+population+monitoring.">Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring.</a> Scientific Reports. 11, (2021).</li><li>Chessel, A., Carazo Salas, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+observing+to+predicting+single-cell+structure+and+function+with+high-throughput/high-content+microscopy.">From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy.</a> Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).</li><li>Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+Aspergillus+nidulans:+meiotic+progeny+for+genetic+analysis+and+strain+construction.">Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction.</a> Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).</li><li>Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi+Using+Vital+Fluorescent+Dyes+and+Confocal+Microscopy.">Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy.</a> Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).</li><li>Trinci, A. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Kinetic+Study+of+the+Growth+of+Aspergillus+nidulans+and+Other+Fungi.">A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi.</a> Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).</li><li>Lichius, A., Zeilinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Membrane+and+Cell+Wall+Selective+Fluorescent+Dyes+for+Live-Cell+Imaging+of+Filamentous+Fungi.">Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).</li><li>Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immersion+oil+for+high-resolution+live-cell+imaging+at+37&#176;C:+optical+and+physical+characteristics.">Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37&#176;C: optical and physical characteristics.</a> Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).</li><li>Distel, M., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+of+Zebrafish+Embryonic+Development.">In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development.</a> CSH protocols. 2007, (2007).</li><li>Walzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portable+low-cost+long-term+live-cell+imaging+platform+for+biomedical+research+and+education.">A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education.</a> Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences.">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Research. 1000, 1494 (2020).</li><li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cell+and+Particle+Tracking.">Methods for Cell and Particle Tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li><li>Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+heterogeneity+in+Methylobacterium+extorquens+AM1.">Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1.</a> Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).</li><li>Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+mechanism+for+the+detoxification+and+assimilation+of+the+toxic+phytoproduct+L-azetidine-2-carboxylic+acid+in+Aspergillus+nidulans.">A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).</li><li>Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+distribution+and+localization+in+the+meiotic+progeny+of+Aspergillus+nidulans.">Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans.</a> Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).</li><li>Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+Organization+in+the+Filamentous+AscomyceteAspergillus+nidulans.">Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans.</a> Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).</li><li>Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+AnNce102+and+its+role+in+eisosome+stability+and+sphingolipid+biosynthesis.">Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2015).</li><li>Pe&#241;alva, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+endocytic+pathway+of+Aspergillus+nidulans+with+FM4-64.">Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64.</a> Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).</li><li>Versari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tracking+of+budding+yeast+cells+in+brightfield+microscopy:+CellStar+and+the+Evaluation+Platform.">Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform.</a> Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).</li><li>Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+Sporulation+in+Aspergillus+nidulans.">Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).</li><li>Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+of+fungal+biofilms.">Microscopy of fungal biofilms.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).</li><li>Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphaTracker:+An+ImageJ+toolbox+for+time-resolved+analysis+of+spore+germination+in+filamentous+fungi.">HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyphArea-Automated+analysis+of+spatiotemporal+fungal+patterns.">HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns.</a> Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).</li><li>Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filamentous+microbial+morphology+with+AnaMorf.">Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf.</a> Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).</li></ol>

Mantar hücre büyümesini ve fenotipini zaman atlamalı mikroskopi ile izlemek, hücresel davranışı gerçek zamanlı ve nicel ve doğru bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır ve belirli bir ilaç tedavisinin ve/veya genetik müdahalenin zaman içinde tespit edilebilir hücre büyümesi veya fenotipik farklılıklarla sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır.
Bu çalışmada, A. nidulans'ta mikrop tüpü ve hiphal ucu büyümesi...

Filamentli mantarlar büyük sosyoekonomik ve ekolojik öneme sahiptir, hem enzim ve antibiyotik üretimi için endüstriyel / tarımsal araçlar olarak çok önemlidir1,2 ve mahsul bitkilerinin patojenleri olarak3, haşere böcekleri4 ve insanlar3. Ayrıca, Aspergillus nidulans gibi filamentli mantarlar, genetik, hücre ve evrimsel biyoloji çalışmaları ve hiphal uzatma çalışmaları gibi temel araştırmalar için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır5. Filamentli mantarlar, membran lipitlerin / proteinlerin sürekli tedariki ve genişleyen uçta hücre duvarının de novo sentezi yoluyla uzanan son derece polarize organizmalardır6. Hipnoz ucu büyümesinde ve polarite bakımında merkezi bir rol, çoğunlukla sitoskeletal bileşenlerden ve Golgi 6,7,8'inpolarizedağılımından oluşan yüksek sıralı bir yapı olan 'Spitzenkorper' (SPK) adlı özel bir yapıdır.
Çevresel uyaranlar/sinyaller, bu tür su-hava arayüzü, ışık, CO2 konsantrasyonu ve beslenme durumu bu kalıplar tarafından verilen gelişimsel kararlardan sorumludur9. Batık (sıvı) kültürlerde A. nidulanların farklılaşması bastırılır ve hiphal ucu uzaması ile büyüme meydana gelir6. Vejetatif büyüme sırasında, aseksüel sporlar (conidia) apikal uzantı ile çimlenir ve besinler ve alan mevcut olduğu sürece süresiz olarak büyümeye devam edebilecek farklılaşmamış bir birbirine bağlı hiphal hücreleri ağı olan miselyum oluşturur. Öte yandan, katı medya hipnoz ipuçları elongate ve vejetatif büyüme (gelişimsel yetkinlik) belirli bir süre sonra, aseksüel üreme başlatılır ve hava konidiophore sapları miselyumun özel ayak hücrelerinden uzanır6. Bunlar, uygun çevresel koşullar altında büyümeyi yeniden başlatabilen uzun haploid konidia10 zincirleri üreten konidiophores adı verilen özel gelişimsel çok hücreli yapılara yol açabilir.
Filamentli mantar büyümesini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, bir Petri kabında bulunan besin agarındaki sporları aşılamak ve birkaç gün sonra koloninin çapını makroskopik olarakölçmektir 11. Koloninin çapı/alanı, en çok misel büyüme hızındaki değişikliklere ve konidiophore yoğunluğuna daha az bağlı12, daha sonra büyüme değeri olarak kullanılır. Katı yüzeylerde büyüyen mantar popülasyonu (koloni) boyutunu ölçmek oldukça yeterli olmasına rağmen, hiçbir şekilde büyümenin en doğru ölçüsü değildir. Nüfus düzeyi ortalamaları (mantar kolonisi büyüklüğü ortalamaları) ile karşılaştırıldığında, tek hücre ölçümleri bir hücre popülasyonunun heterojenliğini yakalayabilir ve hücrelerin yeni alt popülasyonlarının tanımlanmasına izin verebilir, durumlar13, dinamikler, yollar ve hücrelerin endojen ve çevresel değişikliklere yanıt verdiği biyolojik mekanizmalar14,15. Mantar hücresi büyümesini ve fenotipini zaman atlamalı mikroskopi ile izlemek tartışmasız en yaygın kullanılan nicel tek hücreli gözlem yaklaşımıdır.
Burada, hem batık kültürlerde hem de katı ortamda A. nidulans suşlarının kutupsal büyümesini analiz etmek ve ölçmek için floresan mikroskopisinin birlikte kullanımından bağımsız olarak kullanılabilen görüntüleri yakalamak için iletilen ışık mikroskopisi tekniklerini (faz kontrastı, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve polarize mikroskopi gibi) kullanarak etiketsiz bir canlı görüntüleme protokolünü detaylandırıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Imaging slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>azhA&#916; ngnA&#916;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: zhA&#916;::pyrGAf; ngnA&#916;::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Casamino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>223030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I8263-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide (Niacinamide)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47865-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>68971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes for Microbiology Culture</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine hydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G052-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>G053-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL004G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 &#181;L</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>VL700G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 &#181;L/clear</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>GC.TIPS.B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin (B2)</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>47861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades NO. 11</td>
			<td>OdontoMed2011</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuA&#916;::argB+&#160; pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genotype: nkuA&#916;::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of aspergillus nidulans growth rate using live microscopy and open-source software

Çoğunlukla hyphae/mycelia apikal büyüme oranındaki değişikliklere bağlı olan filamentli mantarların koloni büyümesinin, koloni büyüklüğü karşılaştırılarak katılaşmış medyada makroskopik olarak tahmin edildiği iyi belirlenmiştir. Bununla birlikte, farklı çevresel/büyüme koşulları altında (pH, sıcaklık, karbon ve azot kaynakları, antibiyotikler vb.) genetik olarak farklı mantar suşlarının veya suşlarının büyüme hızını nicel olarak ölçmek zordur. Böylece, mantar hücre büyümesini daha iyi anlamak için büyüme kinetiğini ölçmek için tamamlayıcı yaklaşımların takibi zorunlu hale gelir. Ayrıca, Aspergillus spp. de dahil olmak üzere filamentli mantarların, katı ortamlar veya batık kültürler üzerinde hava altı koşullar altında farklı büyüme ve farklılaşma modlarına sahip olduğu iyi bilinmektedir. Burada, model mantarı Aspergillus nidulans'ınbüyüme kinetiğini analiz etmek için nicel bir mikroskobik yöntem hem batık kültürlerde hem de katı medyada canlı görüntüleme kullanarak detaylandırıyoruz. Farklı mantar suşlarının büyüme oranlarını, kullanıcıdan önceden görüntü analizi uzmanlığı gerektirmeyecek şekilde biyo-görüntüler için açık kaynaklı, özgür bir yazılım (örneğin Fiji) kullanarak tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde yakalar, analiz eder ve ölçürüz.

Bu protokolün ardından, filamentli mantar A. nidulans'ınfarklı büyüme / gelişim aşamalarına karşılık gelen çeşitli görüntüler yakaladık ve analiz ettik. Bu çalışmada sunulan veriler Fiji yazılımı kullanılarak işlendi ve analiz edildi. Ölçümler csv dosyaları olarak kaydedildi, istatistiksel olarak analiz edildi ve pandalar, numpy, istatistikmodelleri, matplotlib ve seaborn gibi yazılım kütüphaneleri kullanılarak ticari istatistiksel yazılım ve / veya Python programlama dili ku...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software at JoVE.com

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Filamentli mantar A. nidulanslarının hem batık kültürlerde hem de katı ortamda görüntülerini yakalamak, analiz etmek ve büyüme kinetiğini ölçmek için iletilen ışık mikroskopi tekniklerini kullanarak etiketsiz canlı görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol floresan mikroskopi ile birlikte kullanılabilir.

Canlı Mikroskopi ve Açık Kaynaklı Yazılım Kullanılarak Aspergillus nidulans Büyüme Hızının Nicel Analizi

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Bu videoda, iletilen ışık mikroskopisi tekniklerini kullanarak model mantarı aspergillus nidulans'ın görüntülerini yakalamak için etiketsiz canlı görüntüleme protokolünü açıklıyoruz. Bu görüntüleri hem sıvı hem de katı ortamda aspergillus nidulanların büyüme kinetiğini analiz etmek ve ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün görsel gösterimi, kullanıcıların önemli görüntü yakalama ve mikroskopi görüntü işleme adımları hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlar.Filamentli mantar büyümesini ölçmek için kullanılan yaygın bir yöntem, besin agarı içeren bir Petri kabındaki iki aşılanmış mantar sporudur ve birkaç gün sonra gelişmekte olan koloninin çapını ölçmektir. Ancak, bu yaklaşım ince büyüme farklılıklarını ölçecek kadar hassas değildir. Bu nedenle zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak tek hücreli ölçümler geliştirilmiştir.Bu ölçümler sadece doğru ve nicel sonuçlar sağlamakla kalmaz, aynı zamanda bir popülasyondaki farklı hücrelerin büyüme dinamiklerini de yansıtabilir. Ayrıca, bu yaklaşım endojen ve çevresel sinyallere mantar büyüme yanıtlarında yer alan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını amaçlamaktadır. Petri tabaklarına 15 mililitre sıvı besin agarı dökerek başlayın.Kapağı üstüne yerleştirin ve soğumasını bekleyin. Plakaları sterilize etmek için UV radyasyon kullanın. Bir stoktan ilgi mantar suşunu çıkarmadan önce, Bunsen brülöründeki dalgalı halkayı kırmızı sıcak olana kadar ısıtın, halkayı ağar içine bıçaklayarak soğutun.Tüpü girdaplayın ve uygun beslenme gereksinimleri ile desteklenmiş agar minimal ortamının yüzeyinde döngüyü çizgilendirin. Plakaları 37 santigrat derecede iki ila üç gün kuluçkaya yatır. Steril bir kürdan kullanarak, tek bir koloniye hafifçe dokunarak az sayıda konidiayı tam ortam plakalarına aktarın.Plakaları 37 santigrat derecede üç ila dört gün kuluçkaya yatır. Aspergillus nidulans conidia, steril 1.5 mililitre girdap tüpünde toplanır, hacim başına% 0.05 hacim içeren 1.0 mililitre otoklav damıtılmış su ile, konidia kümelerinin sayısını azaltmak için 80. Agar orta yüzeyinde filamentli mantarların görüntülenmesi için ters agar yönteminin değiştirilmiş bir versiyonu kullanılır.Başlangıçta 10 mikrolitre aliquots kuvvetli girdap konidial süspansiyon, yaklaşık iki kez 104 hücre mililitre başına Petri tabaklar üzerinde 15 mililitre minimal orta hacimli bir ağırlık ile hacim agar. Deney kültürünü araştırılacak gelişim evresine göre kuluçkaya yatırın. Burada 30 santigrat derecede üç gün kuluçkaya yatırıyoruz.Daha sonra, steril bir neşter kullanarak koloniyi içeren bir agar bloğunu dilimleyin. Burada koloni kenar boşluğunda bir agar kamasını kesiyoruz, ters çevirip agar dilimini sekiz, iyi bir kaydırağa yerleştiriyoruz. 200 mikrolitre minimal ortam içeren bir kuyu kaydırağı kuyularında yaklaşık iki kez 10'un gücünde 10 mikrolitrelik niquots kuvvetli girdap konidial süspansiyonu uygun takviyelerle aktarın.Her seferinde incelenecek zaman ve sıcaklık için kuluçkaya yatırın. Mikroskop seçimi mevcut ekipmana bağlıdır. Her durumda, mikroskop kurulumu ters bir aşama, bir çevre odası veya en azından hassas hava sıcaklığı kontrolüne sahip bir oda içermelidir.Başlangıçta istenen sıcaklığı stabilize etmek için termostat ve mikroskop odasını önceden ısıtın. Burada sıcaklığı 30 santigrat derece olarak belirledik. Mikroskobu, tarayıcı gücünü, lazer gücünü ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin.Önceden hazırlanmış iyi kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve odaklanın. Görüntü analizi sırasında büyüme ölçümlerini kolaylaştırmak için yalıtılmış, örtüşmeyen veya en azından aşırı kalabalık olmayan görünüm alanları bulun. Kullanılacak iletilen ışık mikroskopi tekniğini seçin ve gerektiğinde floresan için dedektörlerin yanı sıra iletilen ışık dedektörünü de etkinleştirin.Mikroskobu, istenen zaman aralıklarında görüntü elde etmek ve zaman serisi alımını başlatmak için ayarlayın. Görüntülerin yüklenmesi, görselleştirilmesi ve işlenmesi açık kaynaklı imageJ Fiji yazılımı ile gerçekleştirilir. Görüntüleri bir formata göre eklentiler kullanarak Fiji'ye içe aktararak başlayın.Varsayılan renk modunu ve otomatik ölçeği seçin. Bir zaman damgasını ve ölçek çubuğunu yer paylaşımı olarak görselleştirmek için analize, araçlara, ölçek çubuğuna gidin. Ölçek çubuğunun genişliği, yüksekliği, rengi ve konumuyla ilgili istediğiniz parametreleri ayarlayın.ImageJ Fiji yazılımında görüntü özelliklerini görüntülemek için görüntüye, özelliklere gidin. Çerçeve aralığı bilgilerini gözlemleyin. Burada yaklaşık 15 dakikalık bir zaman aralığı kullanıyoruz ve tamam tuşuna basıyoruz.Ardından görüntüye, yığınlara, etikete gidin ve doğru bilgileri aralığa ayarlayın. X ve Y'yi değiştirerek etiketin konumunu ayarlayın.Alan metninde ölçü birimini ayarlayın ve önizlemeye basın. Görüntü, ayarlama, ağartma düzeltme, histogram eşleştirmeyi seçerek farklı kareler arasındaki aydınlatma düzeltmesi için histogram eşleştirmeyi kullanın.Düzeltilmiş aydınlatmalı yeni bir pencere görüntülenir. Büyüyen hiphal ipucunu izlemek için eklentilerde MtrackJ eklentisini kullanın Parçayı eklemek için araç çubuğunda ekle düğmesini seçin ve farenin sol tıklamasını kullanarak ilk noktayı hipnoz ucuna yerleştirin. Zaman serisi otomatik olarak bir sonraki kareye taşınır.İzleme işlemini tamamlamak için, son noktada fareyi çift tıklatın veya kaçış tuşuna basın. Hipnoz ucu büyümesini hesaplamak için en önemli sütun olan çıktı tablosunu kaydırmak, herhangi bir çerçevedeki hızdır. Ölçümleri güvenli bir şekilde izleyin, dosya ekleyin, istediğiniz dosya biçimine kaydedin, örneğin CSV, kaydedilen dosyayı elektronik tablo programınıza alın ve görselleştirmeyi ve diğer testleri hesapleyin.Herhangi bir standart multimedya oynatıcıda görselleştirilebilen, içine parça çizilmiş kareleri içeren bir film, RGB renk türü oluşturmak için film düğmesine basın. Bu protokolün ardından filamentli mantar aspergillus nidulans'ın farklı büyüme ve gelişim evrelerine karşılık gelen çeşitli görüntüler yakaladık ve analiz ettik. Şekil, vahşi tip ve azhAD Delta ngnA Delta büyüme hızı ölçümlerinin karşılaştırmasını göstermektedir.AzhAD Delta ngnA Delta, iki karboksilik aside ek olarak toksik savaşçı ürün L'nin detoksifikasyonu ve asimilasyonunda yer alan iki gende çift silinmiş bir suşdur. Batık sıvı kültürlerindeki vahşi tip suşuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı daha düşük büyüme hızı ölçümleri göstermektedir. Büyümedeki bu fark, bu iki suşun koloni alanının katı minimal ortamda ölçülmesi ile tespit edilemez.Tek hücreli, uzun süreli canlı görüntüleme, hücresel protein dinamiklerinin spasiyal ve zamansal bilgilerini elde etme çabasında önemli bir değere sahip. Bu protokol, uzun süreli canlı hücre görüntülemesi yapmak için de uygundur. Burada GFP etiketli çekirdek eisosomal protein PilA ve mRFP histonen H1'i birlikte ifade eden konidia çimlenmesini görüyoruz. Burada, mantar büyüme kinetiğinin kullanıcıdan önceden herhangi bir görüntü analizi deneyimine gerek kalmadan tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.Bu protokol, mantar büyümesinin objektif olarak doğru ölçülmesini sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...