Name: an intestinal gut organ culture system for analyzing host-microbiota interactions
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00
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Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Yissachar-Labors für ihre wertvollen Beiträge zur Optimierung des Protokolls des Darmorgankultursystems. Wir danken Yael Laure für die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (Förderkennzeichen 3114831), der Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (Zuschuss Nr. 8165162) und dem Gassner Fund for Medical Research, Israel, unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den von der Ethikkommission für Tierschutz genehmigten Tierpflegerichtlinien.
1. Versuchsvorbereitung
<ol><li>Herstellung des Darmorgankulturgeräts (3 Tage)<ol>
<li>Drucken Sie mit einem 3D-Drucker die wiederverwendbaren Kunststoffformen für das Organkulturgerät (das Gerät hat 6 Vertiefungen mit 24 kleinen und großen Löchern und für den Deckel des Geräts) (3D-Dateien beigefügt). HINWEIS: Diese Kunststoffformen können für die Herstellung zahlreicher Gerä...

<ol>
	<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors.">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li><li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine.">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li><li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell/leucocyte+co-cultures.">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li><li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection.">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).</li><li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk.">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li><li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism.">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li><li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function.">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li><li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Dilutions+and+Plating:+Microbial+Enumeration.">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria.">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li><li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro.">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota.">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li><li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells.">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li></ol>

Dieser Artikel beschreibt ein optimiertes Protokoll für Ex-vivo-Darmorgankulturen, das Yissachar et al. kürzlich entwickelt haben (veröffentlichte9 und unveröffentlichte Daten). Das Darmorgankultursystem unterstützt die multiplexierte Kultur intakter Darmfragmente bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des Luminalflusses. Es bietet die volle Kontrolle über die intra- und extralumnale Umgebung (einschließlich Stimulationsdosis, Expositionszeit und Durchflussrate) und bewahrt die naive...

Der Darm ist ein hochkomplexes Organ, das eine breite Palette von Zelltypen (Epithelzellen, Zellen des Immunsystems, Neuronen und mehr) enthält, die in einer bestimmten Struktur organisiert sind, die es den Zellen ermöglicht, miteinander und mit dem Luminalgehalt (Mikrobiota, Nahrung usw.) zu interagieren und zu kommunizieren. 1.Derzeit umfasst die Forschungs-Toolbox, die für die Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen zur Verfügung steht, In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Tiermodelle 2. In-vivo-Tiermodelle bieten eine physiologische Gewebekonstruktion3, jedoch mit schlechter experimenteller Kontrolle und begrenzter Fähigkeit, die Versuchsbedingungen zu manipulieren. In-vitro-Kultursysteme hingegen verwenden Primärzellen oder Zelllinien, die mit Mikroben4ergänzt werden können und eine strenge Kontrolle über die Experimentparameter bieten, aber die zelluläre Komplexität und die Gewebearchitektur fehlen. Moderne In-vitro-Assays ermöglichen die fortgeschrittene Verwendung gesunder und pathologischer menschlicher Gewebeproben, wie Epithelorganoide aus Maus- oder menschlichen Quellen5,6und Proben, die die Schleimhautmikroumgebung nachahmen7. Ein weiteres Beispiel ist der "Gut on a Chip"-Assay, der die menschliche Kolonepithelzelllinie (Caco2), die extrazelluläre Matrix und mikrofluidische Kanäle umfasst, um den physiologischen Zustand der Darminvariante nachzuahmen8. So fortschrittlich und innovativ In-vitro-Proben auch sein mögen, sie behalten jedoch keine normale Gewebearchitektur oder naive Zellzusammensetzung bei.
Um dies zu beheben, haben Yissachar et al. kürzlich ein ex vivo Organkultursystem9 (Abbildung 1) entwickelt, das intakte Darmfragmente ex vivoaufrechterhält und von den Vorteilen sowohl in vivo als auch in vitro Modellen profitiert. Dieses Ex-vivo-Darmorgankultursystem basiert auf einem maßgeschneiderten Kulturgerät, das eine multiplexierte Kultur von sechs Dickdarmgeweben unterstützt, so dass experimentelle Inputs unter vergleichbaren Bedingungen untersucht und gleichzeitig die Ein- und Ausgänge des Systems gesteuert werden können. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass dieses System für die Analyse von Darmreaktionen auf einzelne Darmbakterien9, ganze menschliche Mikrobiotaproben10 und mikrobielle Metaboliten11wertvoll ist. Dieses System ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung dieser frühen Wirt-Mikrobiota-Interaktionen mit einem hohen Maß an Kontrolle über die Wirts-, Mikrobien- und Umweltkomponenten. Darüber hinaus ermöglicht es die Überwachung und Manipulation des Systems während des gesamten Experiments in Echtzeit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Abbildung 1: Schemata der Darmkulturvorrichtung. Ein ganzes Darmgewebefragment ist an den Ausgangs- und Eingangsanschlüssen der Kammer (oben) befestigt, wobei Pumpen den Medienfluss innerhalb des Lumens und in der externen Mediumkammer regulieren. Das gesamte Gerät (unten) enthält 6 solcher Kammern. Diese Zahl wurde von Yissachar et al. 2017 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Gauge Blunt Needle</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>75165a754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 Gauge Blunt Needle</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>75165a758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone</td>
			<td>DAP</td>
			<td>688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves</td>
			<td></td>
			<td>AAAD4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide 1 mm Thick</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2947-75X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Incubator im-10</td>
			<td></td>
			<td>AAH24315K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC 301E Vacuum PUMP</td>
			<td></td>
			<td>VI-412711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>51525k121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>52525k211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow</td>
			<td></td>
			<td>Polydimethylsiloxane, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>6516t11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zortrax M200</td>
			<td>Zortrax</td>
			<td></td>
			<td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zortrax M200 Materials: z-ultrat</td>
			<td>Zortrax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x), Serum Free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Mod Dulbecco&#39;s Medium With Phenol Red (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock-Out Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acid (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissors</td>
			<td>Aseltech</td>
			<td>11-00-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Braided Surgical Thread</td>
			<td>SMI</td>
			<td>8010G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Filter</td>
			<td>Life Gene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Life Gene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer Lock Syringe</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greenough Stereo Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Precision Air Heater &#34;CUBE&#34;</td>
			<td></td>
			<td>CUBE-2-LIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>new era pump systems inc</td>
			<td>nep-ne-1600-em</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestinal gut organ culture system for analyzing host-microbiota interactions

Die Struktur des Darmgewebes ermöglicht enge und mutualistische Interaktionen zwischen dem Wirt und der Darmmikrobiota. Diese Gespräche sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der lokalen und systemischen Homöostase; Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota (Dysbiose) sind mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten verbunden. Methoden zur Sezierung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen umfassen einen inhärenten Kompromiss zwischen der Erhaltung der physiologischen Gewebestruktur (bei Verwendung von In-vivo-Tiermodellen) und dem Grad der Kontrolle über die Versuchsfaktoren (wie in einfachen In-vitro-Zellkultursystemen). Um diesen Kompromiss anzugehen, haben Yissachar et al. kürzlich ein Darmorgankultursystem entwickelt. Das System bewahrt eine naive Dickdarmgewebekonstruktion und zelluläre Mechanismen und ermöglicht auch eine strenge experimentelle Kontrolle, was Experimente erleichtert, die in vivonicht ohne weiteres durchgeführt werden können. Es ist optimal für die Sezierung kurzfristiger Reaktionen verschiedener Darmkomponenten (wie epitheliale, immunologische und neuronale Elemente) auf luminale Störungen (einschließlich anaerober oder aerober Mikroben, ganzer Mikrobiotaproben von Mäusen oder Menschen, Medikamenten und Metaboliten). Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung eines optimierten Protokolls für die Organkultur mehrerer Darmfragmente mit einem maßgeschneiderten Darmkulturgerät. Wirtsreaktionen auf luminale Störungen können durch Immunfluoreszenzfärbung von Gewebeabschnitten oder Gewebefragmenten ganzer Montierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder Zeitrafferbildgebung sichtbar gemacht werden. Dieses System unterstützt eine Vielzahl von Auslesungen, einschließlich Next-Generation-Sequenzierung, Durchflusszytometrie und verschiedene zelluläre und biochemische Assays. Insgesamt unterstützt dieses dreidimensionale Organkultursystem die Kultur von großem, intaktem Darmgewebe und hat breite Anwendungen für die hochauflösende Analyse und Visualisierung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen in der lokalen Darmumgebung.

Das Darmorgankultursystem erhält die Lebensfähigkeit des Gewebes ex vivo. Die Bewertung der Gewebelebensfähigkeit erfolgte während des gesamten Kulturzeitraums. Dickdarmgewebefragmente wurden im Darmorgankultursystem inkubiert und nach 2/12/24 h-Kultur fixiert. Die Integrität der intestinalen Epithelzelle (IEC) wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit E-Cadherin und Cytokeratin-18-Antikörpern validiert. Ebenso wurden schleimgefüllte Speisebleszellen im Dickdarmepithel und Schleimsekretion innerhalb des L...

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An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

Dieser Artikel stellt eine einzigartige Methode zur Analyse von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen unter Verwendung eines neuartigen Darmorgankultursystems für Ex-vivo-Experimente vor.

Ein intestinales Darmorgankultursystem zur Analyse von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Das Darmorgankultursystem vereint die Vorteile von in vitro und in vivo Assays und dient somit als experimenteller Zwischenschritt zwischen einfachen in vitro Assays und komplexen in vivo Experimenten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kombination einer strengen experimentellen Kontrolle mit der Erhaltung der Darmphysiologie. Diese Methode liefert Einblicke in die Analyse der Darmreaktionen auf spezifische Reize mit einem hohen Maß an Kontrolle über den Wirt, die Mikroben und die Umweltkomponenten.Demonstriert wird das Verfahren von Alon Shemesh, einem Masterstudenten aus meinem Labor, und Dr. Sivan Amidror, unserem Labormanager. Führen Sie zunächst die stumpfen Nadeln an die entsprechende Position innerhalb der Geräteform ein und gießen Sie etwa 20 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS-Mischung für einen Satz des Geräts und des Deckels. Legen Sie die Formen für 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen aus der PDMS-Mischung zu entfernen, und inkubieren Sie die Formen dann über Nacht bei 55 Grad Celsius, um die PDMS-Polymerisation abzuschließen.Wenn das PDMS eingestellt ist, ziehen Sie die Nadeln aus der Form heraus und lösen Sie vorsichtig das Kulturgerät und den Deckel aus den Kunststoffformen. Entfernen Sie PDMS-Rückstände aus dem Brunnenumriss mit einer chirurgischen Klinge. Befestigen Sie das PDMS-Gerät und die Geräteabdeckung mit ungiftigem Silikonkleber auf einem Deckglas aus 75 x 50 Millimetern Mikrorutschen und lassen Sie die Teile über Nacht einwirken.Tragen Sie das Geklebte auf die glatte Seite des Geräts auf. Setzen Sie 12, 22 Messnadeln für das Lumen und 12, 18 Messnadeln für den Brunnen ein. Fixieren Sie alle Nadeln mit Silikon und lassen Sie es über Nacht einwirken.Reinigen Sie die Eingangsspritzen und stellen Sie sicher, dass das Brunnenmedium aus allen Rohren in ein Altglas fließt, reinigen Sie dann die Eingangsspritzen und stellen Sie sicher, dass die Stimulationen aus allen Rohren in ein Altglas fließen, wobei Sie darauf achten, die verschiedenen Stimulationen nicht zu kontaminieren. Nachdem Sie die Maus geopfert haben, verwenden Sie eine scharfe Schere und eine Zette, um sie zu sezieren und den Verdauungstrakt vom Magen bis zum Anus herauszunehmen, indem Sie das gesamte Fett und Bindegewebe schneiden. Schneiden Sie den Doppelpunkt ab und legen Sie ihn auf eine neue Platte.Minimieren Sie den Kontakt, während Sie das Gewebe sanft und nur an den Rändern halten. Führen Sie die Dickdarmspülung unter einem Dissektionsmikroskop durch. Spülen Sie den Dickdarminhalt vorsichtig mit sterilem IMDM mit der vorbereiteten 10-Milliliter-Spritze, wie im Text beschrieben.Nachdem Sie den Kot aus dem Darmgewebe entfernt haben, legen Sie den Dickdarm in eine neue Sechs-Well-Platte, die mit 0,5 Milliliter sterilem IMDM gefüllt ist. Als nächstes nehmen Sie das Dickdarmgewebe und verbinden Es vorsichtig mit der 22-Gauge-Nadel, wobei Sie eine enge Verbindung mit den beiden Fäden herstellen. Behalten Sie die korrekte Ausrichtung des Dickdarms zum Lumenfluss bei, so dass der proximale und der distale Ausgang gleich Eingang und Ausgang sind.Wiederholen Sie die Darmspülung und das Nadelknünden für alle Gewebe. Schließen Sie die Ein- und Ausgangsrohre an das Gerät an und beginnen Sie dann das Experiment, indem Sie die Pumpen mit den gewünschten Raten starten. Schleimgefüllte Speisebleszellen im Dickdarmepithel und Schleimsekretion im Lumen wurden ebenso nachgewiesen wie proliferierende IEC in den Kolonkrypten, wie durch KI67-Färbung angezeigt.Diese Ergebnisse zeigten, dass das Darmkultursystem die Darmfunktion und -struktur ex vivo aufrechterhält. Nach zwei Stunden segmentierten filamentösen Bakterien oder SFB-Einführung wurden typische SFB-Filamente in enger Verbindung mit Dünndarmzotten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Zusätzlich präsentierte eine Transmissionselektronenmikroskopie SFB innerhalb weniger Mikrometer der Dünndarmepithelbürstengrenze.Genexpressionsprofile ganzer Gewebeproben wurden in dreifacher Ausfertigung zwei Stunden nach der Infusion mit SFB erstellt. Kontrollkulturen wurden mit fäkalen Suspensionen von keimfreien oder Bacteroides fragilis monokolonisierten Mäusen infundiert. Diese vom SFB überzeugten Veränderungen waren im Vergleich zur keimfreien Kontrolle überwiegend von geringer Amplitude.Die Orientierung des Dickdarms ist sehr wichtig. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie den Dickdarm an der Nadel binden. Die richtige Bindung verhindert die Kontamination des Brunnens mit dem Lumengehalt.Diesem Protokoll kann eine breite Palette von Auslesetechniken folgen, z. B. Sequenzierung der nächsten Generation, Bildgebung, Zellsortierung und vieles mehr. Diese Auslesungen bieten neue Einblicke in die Wechselwirkungen des Wirtsmikrobioms bei Gesundheit und Krankheit.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Optimierung der Manschettentechnik für DieMurine Heart Transplantation

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...