Name: an intestinal gut organ culture system for analyzing host-microbiota interactions
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions at JoVE.com

Yissachar laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bağırsak organ kültürü sistemi protokolünü optimize etmedeki değerli katkıları için teşekkür ederiz. Yael Laure'ye makalenin eleştirel düzenlemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (3114831 No. hibe), İsrail Bilim Vakfı - Broad Institute Ortak Programı (8165162 Sayılı hibe) ve gassner Tıbbi Araştırma Fonu, İsrail tarafından desteklendi.

Bu protokol, hayvan refahı etik komitesi tarafından onaylanan hayvan bakım yönergelerini izler.
1. Deney hazırlığı
<ol><li>Bağırsak organ kültürü cihazının imalatı (3 gün)<ol>
<li>3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir). NOT: Bu plastik kalıplar çok sayıda cihazın imalatı için kullanılabi...

<ol>
	<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors.">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li><li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine.">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li><li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell/leucocyte+co-cultures.">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li><li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection.">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).</li><li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk.">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li><li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism.">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li><li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function.">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li><li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Dilutions+and+Plating:+Microbial+Enumeration.">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria.">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li><li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro.">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota.">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li><li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells.">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li></ol>

Bu makalede, Yissachar ve arkadaşlarının yakın zamanda geliştirdiği ex vivo gut organ kültürleri için optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır(yayınlanan 9 ve yayınlanmamış veriler). Bağırsak organ kültürü sistemi, parlak akışı korurken sağlam bağırsak parçalarının çok yönlü kültürünü destekler. İl içi ve ekstra-luminal ortam (stimülasyon dozu, maruz kalma süresi ve akış hızı dahil) üzerinde tam kontrol sağlar ve naif bağırsak dokusu ...

Bağırsak, hücrelerin birbirleriyle ve ışık içeriğiyle (mikrobiyota, gıda vb.) etkileşime girmesini ve iletişim kurmasını sağlayan belirli bir yapıda düzenlenmiş çok çeşitli hücre tipleri (epitel hücreleri, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar ve daha fazlası) içeren son derece karmaşık bir organdır. 1. Şu anda, konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmek için mevcut olan araştırma araç kutusu in vitro hücre kültürlerini ve in vivo hayvan modellerini içerir2. In vivo hayvan modelleri fizyolojik doku konstrüksiyon3 sağlar, ancak zayıf deneysel kontrol ve deney koşullarını manipüle etme yeteneği sınırlıdır. İn vitro kültür sistemleri ise, mikroplarla desteklenebilen birincil hücreleri veya hücre hatlarını kullanın4Deney parametreleri üzerinde sıkı kontrol sağlar, ancak hücresel karmaşıklıktan ve doku mimarisinden yoksundur. Modern in vitro tahliller, fare veya insan kaynaklarından elde edilen epitel organoidler 5,6ve mukozal mikroçevreyi taklit eden örnekler gibi sağlıklı ve patolojik insan dokusu örneklerinin ileri düzeyde kullanılmasına izin verir7. Başka bir örnek, bağırsak değişmez8'infizyolojik durumunu taklit etmek için insan kolonik epitel hücre hattı (Caco2), hücre dışı matris ve mikroakışkan kanalları içeren 'çip üzerindeki bağırsak' tahlildir. Bununla birlikte, in vitro örnekler ne kadar gelişmiş ve yenilikçi olsalar da, normal bir doku mimarisi veya naif hücresel bileşim sağlamaz.
Bunu ele almak için, Yissachar ve arkadaşları son zamanlarda sağlam bağırsak parçalarını koruyan bir ex vivo organ kültürü sistemi geliştirdi9 (Şekil 1) ex vivo, hem in vivo hem de in vitro modellerin avantajlarından yararlanıyor. Bu ex vivo gut organ kültürü sistemi, altı kolon dokusunun çok katlı kültürünü destekleyen, sistemin giriş ve çıkışlarını kontrol ederken benzer koşullar altında deneysel girdilerin incelenmesine izin veren özel yapım bir kültür cihazına dayanmaktadır. Son çalışmalar, bu sistemin bireysel bağırsak bakterilerine bağırsak yanıtlarını analiz etmek için değerli olduğunu göstermiştir9, tüm insan mikrobiyota örnekleri10 ve mikrobiyal metabolitler11. Bu sistem, ilk kez, bu erken konak-mikrobiyota etkileşimlerinin konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrol ile incelenmesine izin verir. Ayrıca, deney boyunca sistemin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve manipüle etmesine izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Şekil 1: Bağırsak kültürü cihazının şemaları. Bütün bir bağırsak dokusu parçası, odanın çıkış ve giriş portlarına (üstte), lümenin içindeki ve dış orta odanın içindeki orta akışı düzenleyen pompalarla tutturulur. Tüm cihaz (altta) bu tür 6 odacık içerir. Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 Gauge Blunt Needle</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>75165a754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 Gauge Blunt Needle</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>75165a758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone</td>
			<td>DAP</td>
			<td>688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves</td>
			<td></td>
			<td>AAAD4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide 1 mm Thick</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2947-75X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Incubator im-10</td>
			<td></td>
			<td>AAH24315K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC 301E Vacuum PUMP</td>
			<td></td>
			<td>VI-412711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>51525k121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>52525k211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow</td>
			<td></td>
			<td>Polydimethylsiloxane, PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Mcmaster</td>
			<td>6516t11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zortrax M200</td>
			<td>Zortrax</td>
			<td></td>
			<td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zortrax M200 Materials: z-ultrat</td>
			<td>Zortrax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x), Serum Free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Mod Dulbecco&#39;s Medium With Phenol Red (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock-Out Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acid (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissors</td>
			<td>Aseltech</td>
			<td>11-00-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Braided Surgical Thread</td>
			<td>SMI</td>
			<td>8010G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Filter</td>
			<td>Life Gene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Life Gene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer Lock Syringe</td>
			<td>B-D</td>
			<td>309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greenough Stereo Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Precision Air Heater &#34;CUBE&#34;</td>
			<td></td>
			<td>CUBE-2-LIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>new era pump systems inc</td>
			<td>nep-ne-1600-em</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an intestinal gut organ culture system for analyzing host-microbiota interactions

Bağırsak dokusunun yapısı, konakçı ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki yakın ve karşılıklı etkileşimleri kolaylaştırır. Bu çapraz görüşmeler yerel ve sistemik homeostazların sürdürülmesi için çok önemlidir; bağırsak mikrobiyota bileşimindeki (disbiyozis) değişiklikler çok çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir. Konak-mikrobiyota etkileşimlerini inceleme yöntemleri, fizyolojik doku yapısının korunması (in vivo hayvan modelleri kullanırken) ve deney faktörleri üzerindeki kontrol seviyesi (basit in vitro hücre kültürü sistemlerinde olduğu gibi) arasında doğal bir dengeyi kapsar. Bu dengeyi ele almak için, Yissachar ve arkadaşları yakın zamanda bir bağırsak organı kültür sistemi geliştirdiler. Sistem naif bir kolon dokusu yapımını ve hücresel mekanizmaları korur ve ayrıca sıkı deneysel kontrole izin vererek vivoolarak kolayca gerçekleştirilemeyen deneyleri kolaylaştırır. Çeşitli bağırsak bileşenlerinin (epitel, immünolojik ve nöronal elementler gibi) kısa süreli yanıtlarını ışık pertürbasyonlarına (anaerobik veya aerobik mikroplar, farelerden veya insanlardan gelen tüm mikrobiyota örnekleri, ilaçlar ve metabolitler dahil) ayırmak için en uygun olanıdır. Burada, özel yapım bir bağırsak kültürü cihazı kullanarak birden fazla bağırsak parçasının organ kültürü için optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Luminal pertürbasyonlara konak yanıtları, doku bölümlerinin veya tüm montajlı doku parçalarının immünofluoresans boyanması, floresan yerinde hibridizasyon (FISH) veya zaman atlamalı görüntüleme ile görselleştirilebilir. Bu sistem, yeni nesil sıralama, akış sitometrisi ve çeşitli hücresel ve biyokimyasal tahliller de dahil olmak üzere çok çeşitli okumaları destekler. Genel olarak, bu üç boyutlu organ kültürü sistemi büyük, bozulmamış bağırsak dokularının kültürünü destekler ve yerel bağırsak ortamında konak-mikrobiyota etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü analizi ve görselleştirilmesi için geniş uygulamalara sahiptir.

Bağırsak organ kültürü sistemi doku canlılığını korur ex vivo. Doku canlılığının değerlendirilmesi kültür dönemi boyunca yapıldı. Kolon dokusu parçaları bağırsak organ kültürü sisteminde inkübe edildi ve 2/12/24 saat kültürü takiben sabitlendi. Bağırsak epitel hücre (IEC) tabaka bütünlüğü E-cadherin ve sitokeratin-18 antikorları kullanılarak immünofluoresans lekelenmesi ile doğrulandı. Aynı şekilde, ki-67 boyama ile belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu...

Watch this Scientific Journal Video about An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions at JoVE.com

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Bağırsak organ kültürü sistemi in vitro ve in vivo tahlillerin avantajlarını birleştirir ve böylece basit in vitro tahliller ile karmaşık in vivo deneyler arasında bir ara deneysel adım görevi görür. Bu tekniğin temel avantajı, sıkı deneysel kontrolün bağırsak fizyolojisinin korunması ile kombinasyonudur. Bu yöntem, konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrole sahip belirli uyaranlara bağırsak yanıtlarını analiz etmek için içgörü sağlar.Prosedürü gösterenler laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Alon Shemesh ve laboratuvar müdürümüz Dr. Sivan Amidror olacak. Başlamak için, künt uçlu iğneleri cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 gram polidimetilsiloksan veya PDMS karışımı dökün. Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin, ardından PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın. Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak 75 ila 50 milimetrelik bir kapak camına takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak için bırakın.Yapıştırılmışı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın. Lümen için 12, 22 ölçer iğne ve kuyu için 12, 18 ölçer iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın.Giriş şırınmalarını temizle ve kuyu ortamının tüm tüplerden bir atık cama aktığından emin olun, ardından giriş şırınnalarını temizleyin ve farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat ederek stimülasyonların tüm tüplerden atık bir bardağa akmasını sağlar. Fareyi feda ettikten sonra, tüm yağ ve bağ dokularını keserek, onu parçalamak ve sindirim sistemini mideden anüse çıkarmak için keskin makas ve tokmak kullanın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin.Dokuyu hafifçe ve sadece kenarlarda tutarken teması en aza indirin. Kolon yıkamayı bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirin. Kolon içeriğini metinde açıklandığı gibi hazırlanan 10 mililitre şırınna ile steril IMDM ile hafifçe yıkayın.Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mililitre steril IMDM ile dolu yeni bir altı kuyu plakasına yerleştirin. Daha sonra, kolon dokusunu alın ve iki iplikle sıkı bir bağ yaparak 22 kalibrelik iğneye dikkatlice bağlayın. İki nokta üst üste lümen akışına doğru yönlendirmeyi koruyun, böylece proksimal ve distal sırasıyla giriş ve çıkışa eşittir.Tüm dokular için kolon yıkama ve iğneyi tekrarlayın. Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın, ardından pompaları istediğiniz oranlarda çalıştırarak deneye başlayın. Ki67 lekelemede belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu kadeh hücreleri ve lümen içindeki mukus salgısı ve kolonik mahzenlerde çoğalma IEC'si tespit edildi.Bu sonuçlar bağırsak kültürü sisteminin bağırsak fonksiyonunu ve yapısı ex-vivo'yu koruduğunu göstermiştir. İki saatlik segmentli filamentli bakteriler veya SFB, girişten sonra, floresan in situ hibridizasyon kullanılarak ince bağırsak villi ile yakın ilişkide tipik SFB filamentleri tespit edildi. Ek olarak, bir iletim elektron mikroskopisi ince bağırsak epitel fırçası sınırının birkaç mikron içinde SFB sundu.Tüm doku örneklerinin gen ekspresyon profilleri SFB ile infüzyondan iki saat sonra üç taraflı olarak üretildi. Kontrol kültürleri mikropsuz veya Bacteroides fragilis monokolonize farelerin dışkı süspansiyonları ile aşılandı. SFB tarafından ikna edilen bu değişiklikler, mikropsuz kontrole kıyasla çoğunlukla küçük genlikteydi.Kolonun yönü son derece önemlidir. Kolonu iğneye tanırken ekstra dikkatli olun. Uygun kravat, kuyunun lümen içeriği ile kirlenmesini önleyecektir.Yeni nesil sıralama, görüntüleme, hücre sıralama ve daha fazlası gibi çok çeşitli okuma teknikleri bu protokolü izleyebilir. Bu okumalar, sağlık ve hastalıkta konak mikrobiyom etkileşimleri hakkında yeni bilgiler sağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

<em&gt; Ex Vivo</emAntimikrobiyal Konak savunma Çalışmaları&gt; Kolon Organ Kültür ve Kullanımı

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Murin Kalp Nakli için Manşet Tekniğinin Optimizasyonu

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...