Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124); بواسطة PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS، construyendo SALUD، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار؛ من قبل Direcció العام d'Investigació، كونسيليريا دي إنفيستيغاسيو، الحكم بالار (FPI/2046/2017)؛ من برنامج FOLIUM ما بعد الدكتوراه (FOLIUM 17/01) ضمن FUTURMed ، الممول بنسبة 50٪ من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار و 50٪ من قبل ESF ؛ ومن قبل لجنة دوسينسيا إي إنفيستياسيو دي لا فونداسيو بانك دي سانغ إي تيكسيتس دي ليه إيلي بالار (CDI21/03).

ملاحظة: تم الحصول على نباتات الغضروف من البنك الحيوي IdISBa (IB 1995/12 BIO) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بعد الموافقة الأخلاقية للمشروع من قبل CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. إعداد العمود
<ol><li>أعمدة متساوية تتبع إرشادات الشركة المصنعة أو كما يلي:<ol>
<li>قم بإزالة غطاء العمود وتوازن العمود. قم بإزا?...

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions.">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis.">et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression.">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury.">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li><li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair.">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis:+a+systematic+review.">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).</li><li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions.">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li><li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response.">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).</li><li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy.">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).</li><li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA,+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment.">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li><li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes.">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).</li><li>de Miguel P&#233;rez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis,+intracellular+sorting,+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells.">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis.">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extracellular+vesicles:+Current+and+emerging+methods.">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li><li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry.">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

يساعد التصوير EV على فهم خصائص EV، مثل آليات إطلاقها واستيعابها. يسمح تصويرهم بمراقبة التوزيع الحيوي وتوصيف خصائصهم الدوائية كمركبات دوائية. ومع ذلك، قد يكون التصوير EV وتتبع صعبة نظرا لأحجامها الصغيرة، على الرغم من أن العديد من أجهزة التصوير وتقنيات وضع العلامات قد وضعت لمساعدة الباحثين م?...

هشاشة العظام (OA) هو مرض تنكسي مفصلي ينطوي على التهاب تدريجي ولا رجعة فيه وتدمير المصفوفة خارج الخلية للغضاريف المفصلية1. على الرغم من أن أشكال مختلفة من التهاب المفاصل لديها العديد من العلاجات2,3,4, هذه مقيدة بآثارها الجانبية وفعالية محدودة. تقنيات هندسة الأنسجة باستخدام زرع chondrocyte الذاتية يتم تطبيقها بشكل روتيني للعلاج التجديدي للغضاريف المصابة في آفات غضروف الزراعة العضوية في وقت مبكر4. تقتصر العلاجات المستندة إلى الخلايا بشكل رئيسي بسبب العدد المحدود من الخلايا الشوندروجينية المستقرة أو المتجانسات القادرة على إصلاح الغضاريف3بشكل فعال. لذلك ، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع تطور المرض وتجديد آفات الغضاريف الكبيرة له أهمية قصوى.
الحويصلات خارج الخلية (EVs) وقد اقترح كعلاج لOA من قبل مؤلفين مختلفين5,6. المركبات الكهربائية هي أجسام ممبرانية تفرزها غالبية أنواع الخلايا ، وتشارك في الإشارات بين الخلايا ، وقد ثبت أنها تمارس الآثار العلاجية للخلايا الجذعية7،8،9، والتي أثارت مؤخرا اهتماما بالطب التجديدي10. المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا النجمية المتوسطة (MSCs) هي المركبات الكهربائية العلاجية الرئيسية التي تم التحقيق فيها ل OA ، على الرغم من استخدام الخلايا الأخرى ذات الصلة بالمفاصل كمصادر EV ، على سبيل المثال ، chondroprogenitors أو الخلايا المناعية11،12.
وتستخدم تركيزات الصفائح الدموية، مثل lysates الصفائح الدموية (PLs)، لتعزيز التئام الجروح في إصابات مختلفة، مثل قرحة القرنية13،14،15 أو في تجديد أنسجة الأوتار16،بسبب فرضية أن مكون EV من مركزات الصفائح الدموية قد تكون مسؤولة عن هذه الآثار17 . تستخدم بعض الدراسات المتعلقة بالأمراض المرتبطة بالمفاصل المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية (PL-EVs) كعلاج لتحسين حالات هشاشة العظام. PL-EVs تحسين انتشار chondrocyte وهجرة الخلايا عن طريق تفعيل Wnt / β-catenin المسار18, تعزيز التعبير عن علامات الشوندروجيني في chondrocytes هشاشة العظام19, أو تظهر مستويات أعلى من البروتينات الشوندروجينية وتشوهات أقل تيسي في الأرانب هشاشة العظام تعامل مع PL-EVs18.
تحتوي المركبات الكهربائية على البروتينات والدهون والأحماض النووية التي يتم تحريرها إلى الخلية المستهدفة ، مما يؤسس للاتصال من خلية إلى خلية ، وهي الميزة الرئيسية المتعلقة بتطبيقاتها العلاجية20. تعتمد آثار المركبات الكهربائية على وصولها إلى الخلايا وإطلاق الشحنات اللاحقة. يمكن تأكيد هذا التأثير بشكل غير مباشر من خلال التغيرات التي تحدث في الخلايا، مثل النشاط الأيضي أو تعديل التعبير الجيني. ومع ذلك، لا تسمح هذه الطرق تصور كيفية وصول المركبات الكهربائية إلى الخلايا لممارسة وظيفتها. وهكذا، تقدم هذه الورقة طريقة لتسمية هذه المركبات الكهربائية المشتقة من PL لاستخدامها كعلاج لنباتات غضروف الزراعة العضوية التي يحركها الالتهاب. تم استخدام المجهر Confocal لرصد امتصاص EV والتقدم إلى chondrocytes موجودة في explants في الفاصل الزمني من 5 ساعة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

تستخدم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في دراسات مختلفة لإثبات إمكاناتها كعلاج خال من الخلايا بسبب حمولتها المستمدة من مصدرها الخلوي ، مثل lysate الصفائح الدموية (PL). عند استخدامها كعلاج، من المتوقع أن تدخل المركبات الكهربائية الخلايا المستهدفة وتؤثر على استجابة من هذه. في هذا البحث، تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من PL كعلاج خال من الخلايا لهشاشة العظام (OA). وهكذا، تم إعداد طريقة لتسمية المركبات الكهربائية واختبار امتصاصها على النباتات الغضاريف. وصفت المركبات الكهربائية المشتقة PL مع صبغة الدهون PKH26، وغسلها مرتين من خلال عمود، ومن ثم اختبارها في نموذج الزراعة العضوية في المختبر يحركها الالتهاب لمدة 5 ساعة بعد تحديد كمية الجسيمات عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كل ساعة، يتم إصلاح النباتات الغضاريف، paraffined، مقطعة إلى أقسام 6 ميكرومتر لتركيب على الشرائح، ولاحظ تحت المجهر confocal. وهذا يسمح بالتحقق مما إذا كانت المركبات الكهربائية تدخل الخلايا المستهدفة (chondrocytes) خلال هذه الفترة وتحلل تأثيرها المباشر.

يتم عرض نظرة عامة تخطيطية ل EV وضع العلامات ومراقبة امتصاص في الشكل 1. يظهر تركيز الجسيمات وحجم EV الذي اكتشفه NTA في الجدول 1 أن تركيز EV ينخفض أثناء العملية بسبب خطوة التنقية التي أجريت مرتين بعد وضع العلامات مع العمود. ومع ذلك، فإن الكمية التي تم الحصول عليها هي في الن...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

هنا، نقدم بروتوكول لتسمية الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الصفائح الدموية لرصد هجرتها وامتصاصها في النباتات الخارجية الغضاريف المستخدمة كنموذج لهشاشة العظام.

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

يسمح هذا البروتوكول البسيط للمرء بتسمية المركبات الكهربائية ومراقبتها عن طريق المجهر الكونفوفيكال. على سبيل المثال، قد يساعد التصوير EV في تقييم توزيع EV عند استخدامه في العلاجات. هذه التقنية تسمح للمرء لرصد الهجرة EV واستيعاب في explants الغضاريف بسهولة، مع المجهر confocal دون أي وظيفة خاصة.يمكن استخدام نفس البروتوكول للمركبات الكهربائية في المختبر أو في تجارب الجسم الحي. تأكد من أن يتم إعداد الأعمدة مسبقا، وأن الحجم الأولي من المركبات الكهربائية يكفي للوصول إلى تركيز الجسيمات النهائي المطلوب، معتبرا أن حوالي 10٪ من الجسيمات سوف تضيع خلال خطوة تنقية. ابدأ بتركيز الحويكل خارج الخلية، أو EV، العينة والتحكم.ضع العينات في أنبوب تركيز 15 ملليلتر أو 500 ميكرولتر، اعتمادا على الحجم الأولي لعينة EV. طرد الأنابيب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حتى يتم الحصول على عينة جافة تقريبا. إعادة تعليق عينات EV المركزة مع 200 ميكرولتر، ومجموعة التحكم مع 100 ميكرولتر من السيلتر C، ونقلها إلى أنابيب طرد مركزي جديدة 1.5 ملليلتر.فصل عينة EV إلى اثنين من aliquots من 100 ميكرولتر لكل منهما. مارك واحدة من aliquots مع صبغ واستخدامها كعلاج. اترك الآخر بدون علامة ، ولكن قم بمعالجته مثل عينة EV ، واستخدمه لتحديد تركيز EV عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية.إعداد محلول صبغ 2x بحيث التركيز الناتج من محلول PKH26 في C diluent هو ثمانية ميكرومولار. اخلط ميكرولتر واحد من وصلة PKH26 أحادية المليمول لكل 125 ميكرولتر من الذوبان C في العينة. إعداد وحدة التخزين المطلوبة لإضافتها إلى العينات بنسبة 1:1.إضافة محلول صبغ 2x إلى PKH الصفائح الدموية المركبات الكهربائية المشتقة من الليسات وعينات التحكم في نسبة 1:1، لتحقيق تركيز صبغة 1x، وأربعة تركيز PKH26 ميكرومولار. أضف نفس حجم برنامج تلفزيوني إلى عينة EV المشتقة من الصفائح الدموية NTA. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.إضافة 5٪ مصل البقر الألبومين-PBS الحل للعينات في نسبة 1:1، وضمان أن الحجم النهائي هو ما يقرب من 400 ميكرولتر. تابع لفصل المركبات الكهربائية المسماة عن الصبغة غير المنضمة وتفاعلات الصبغة غير المحددة مع العمود. إزالة الغطاء من العمود، إضافة 400 ميكرولتر من الصفائح الدموية PKH المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية، NTA الصفائح الدموية المشتقة من المركبات الكهربائية، أو السيطرة والتخلص من جميع السائل الملتح.انتظر حتى تدخل العينة العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع السائل الملتوية. انتظر برنامج تلفزيوني لإدخال العمود تماما قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع جزء صغير من 600 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. بالنسبة لعمود جديد، كرر الخطوات التي تتضمن تركيز العينات المذكورة في بداية البروتوكول. إضافة 600 ميكرولتر من EVs التي تم إلتواءها سابقا إلى العمود وتجاهل وحدة التخزين الملتوية.ثم أضف 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع وحدات التخزين الملتوية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى العمود وجمع جزء صغير من 600 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. غسل الغضروف مرتين مع برنامج تلفزيوني والمكوس باستخدام لكمة خزعة قطرها ثلاثة ملليمترات في ظل ظروف معقمة.وضع explants في لوحات ثقافة 96 جيدا مع DMEM-F12 المتوسطة، تكملها مع 1٪ من العقديات البنسلين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2، والرطوبة 80٪. لإنشاء نموذج الزراعة العضوية المدفوعة بالالتهاب ، قم بمكمل متوسط ثقافة الخلية مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من oncostatin M واثنين من النانوجرام لكل ملليلتر من عامل نخر الورم ألفا. علاج explants مع 1 مرات 10 إلى الجسيمات 9 لكل بئر من PKH الصفائح الدموية المشتقة من التحلل المركبات الكهربائية، أو السيطرة، في خلية ثقافة المتوسطة تكملها oncostatin M ونخر الورم عامل ألفا.إزالة المتوسطة من لوحات ثقافة الخلية 96 جيدا التي تحتوي على explants الغضاريف. أضف 200 ميكرولتر من وسيط ثقافة الخلية إلى كل بئر كما هو موضح في المخطوطة. أوقف الفحص في المختبر كل ساعة من صفر إلى خمس ساعات.غسل آبار ثقافة الخلية التي تحتوي على explants الغضاريف مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد إلى الأنسجة لإصلاحه لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية. إزالة PFA، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وتخزين الأنسجة الثابتة في أربع درجات مئوية، ومعالجة العينات في غضون 48 ساعة.تظهر الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة كيف تدخل المركبات الكهربائية الأنسجة حتى تصل إلى الخلايا الشوندرية، وتدخل الشوندروسيتيات بمرور الوقت. تم بالفعل توطين المركبات الكهربائية المسماة حول chondrocytes بعد ساعة واحدة من الحضانة. تأكد من أن الحجم الأولي للمركبات الكهربائية يكفي للوصول إلى تركيز الجسيمات النهائي المطلوب.شيء آخر مهم أن نتذكر هو استخدام المركبات الكهربائية المسمى في غضون الساعات ال 24 المقبلة. إذا لم يتم استخدامه في غضون 24 ساعة ، فقد يحدث انخفاض في الفلورسينس. ستساعد هذه التقنية الباحثين على تحسين التصوير EV ، ودراسة المركبات الكهربائية في علم الأحياء والعلاجات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

التصور في الوقت الحقيقي وتحليل للإصابة تشوندروسيتي بسبب تحميل الميكانيكية في Explants الغضاريف موريني سليمة تماما

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...