Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Denne forskning er finansieret af Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansieret af ESF's Europæiske Socialfond og EFRU's Europæiske Fond for Regionaludvikling (MS16/00124; CP16/00124); af PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansieret af den bæredygtige turismeafgift på De Baleariske Øer; af Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); af FOLIUM's postdoctorale program (FOLIUM 17/01) inden for FUTURMed, finansieret med 50% af den bæredygtige turismeafgift på De Baleariske Øer og med 50% af ESF; og af Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

BEMÆRK: Brusk explants blev opnået fra IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer efter etisk godkendelse af projektet af CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Søjleforberedelse
<ol><li>Ekvilibrere kolonner efter fabrikantens anvisninger eller som følger:<ol>
<li>Fjern kolonnehætten, og ekvilibrere kolonnen. Fjern lagerbufferen ved at elution.</li>
		<li>Kolonnen vaskes 3 gange med 2,5 mL fosfatbufferet saltvand (PBS). Under hver vask skal du vente på, a...

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions.">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis.">et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression.">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury.">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li><li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair.">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis:+a+systematic+review.">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).</li><li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions.">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li><li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response.">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).</li><li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy.">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).</li><li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA,+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment.">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li><li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes.">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).</li><li>de Miguel P&#233;rez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis,+intracellular+sorting,+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells.">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis.">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extracellular+vesicles:+Current+and+emerging+methods.">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li><li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry.">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

EV imaging hjælper med at forstå EV egenskaber, såsom deres frigivelse og optagelse mekanismer. Deres billeddannelse gør det muligt at overvåge deres biodistribution og karakteriseringen af deres farmakokinetiske egenskaber som lægemiddelkøretøjer. Ev-billeddannelse og sporing kan dog være vanskelig på grund af deres små størrelser, selvom mange billedbehandlingsenheder og mærkningsteknikker er blevet udviklet for at hjælpe forskere med at overvåge elbiler under in vitro- og in vivo-forhold</e...

Slidgigt (OA) er en leddelt degenerativ sygdom, der indebærer en progressiv og irreversibel betændelse og ødelæggelse af den ekstracellulære matrix af ledbrusk1. Selv om forskellige former for gigt har mange behandlinger2,3,4, disse er begrænset af deres bivirkninger og begrænset effekt. Vævsteknikker ved hjælp af autolog chondrocyt implantation anvendes rutinemæssigt til regenerativ behandling af skadet brusk i begyndelsen af OA brusklæsioner4. Cellebaserede behandlinger er begrænset primært på grund af det begrænsede antal fænotypisk stabile chondrocytter eller chondroprogenitors i stand til effektivt at reparere brusk3. Derfor er udviklingen af nye terapeutiske strategier til forebyggelse af sygdomsprogression og regenerere store brusklæsioner af afgørende betydning.
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er blevet foreslået som en behandling for OA af forskellige forfattere5,6. Elbiler er membranøse organer udskilles af de fleste celletyper, er involveret i intercellulær signalering og har vist sig at udøve stamcellers terapeutiske virkninger7,8,9, som de for nylig har fremkaldt interesse for regenerativ medicin10. Elbiler, der stammer fra mesenkymale stromalceller (MSC'er), er de vigtigste terapeutiske elbiler, der undersøges for OA, selv om andre ledrelaterede celler er blevet anvendt som EV-kilder, f.eks. chondroprogenitors eller immunceller11,12.
Blodpladekoncentrater, såsom blodplade lysater (PLs), bruges til at forbedre sårheling i forskellige skader, såsom hornhindesår13,14,15 eller i senevæv regenerering16, på grund af hypotesen om, at EV komponent af blodplade koncentrater kan være ansvarlig for disse virkninger17 . Nogle undersøgelser vedrørende ledrelaterede sygdomme anvender blodplade-afledte elbiler (PL-elbiler) som en behandling for at forbedre osteoarthritiske tilstande. PL-elbiler forbedrer spredningen af chondrocyt og cellemigration ved at aktivere Wnt/β-cateninvej18, fremme ekspressionen af chondrogenic markører i osteoarthritiske chondrocytter19eller vise højere niveauer af chondrogenice proteiner og færre tissular abnormiteter hos osteoarthritiske kaniner behandlet med PL-EVs18.
Elbiler indeholder proteiner, lipider og nukleinsyrer, der frigøres til målcellen, og etablerer celle-til-celle kommunikation, som er det vigtigste træk relateret til deres terapeutiske anvendelser20. Virkningerne af elbiler afhænger af, om de når celler og efterfølgende lastudslip. Denne effekt kan bekræftes indirekte af ændringer forårsaget i celler, såsom metabolisk aktivitet eller genekspression modifikation. Disse metoder tillader dog ikke visualisering af, hvordan elbiler når celler for at udøve deres funktion. Således, dette papir præsenterer en metode til at mærke disse PL-afledte elbiler, der skal anvendes som en behandling for betændelse-drevet OA brusk explants. Konfokalmikroskopi blev brugt til at overvåge EV-optagelse og progression til de chondrocytter, der var til stede i explanterne i en time-lapse på 5 timer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

Ekstracellulære vesikler (elbiler) bruges i forskellige undersøgelser for at bevise deres potentiale som en cellefri behandling på grund af deres last afledt af deres cellulære kilde, såsom blodplade lysat (PL). Når det bruges som behandling, forventes elbiler at komme ind i målcellerne og påvirke et svar fra disse. I denne forskning er PL-afledte elbiler blevet undersøgt som en cellefri behandling for slidgigt (OA). Der blev således oprettet en metode til at mærke elbiler og teste deres optagelse på brusk explants. PL-afledte elbiler er mærket med lipophilic farvestof PKH26, vaskes to gange gennem en kolonne, og derefter testet i en in vitro inflammation-drevet OA model for 5 timer efter partikel kvantificering af nanopartikler tracking analyse (NTA). Hver time, brusk explants er faste, paraffineret, skåret i 6 μm sektioner til at montere på dias, og observeret under en konfokal mikroskop. Dette gør det muligt at kontrollere, om elbiler kommer ind i målcellerne (chondrocytter) i denne periode og analyserer deres direkte virkning.

Der vises en skematisk oversigt over EV-mærkning og optagelsesovervågning i figur 1. Partikelkoncentrationen og EV-størrelsen, der er registreret af NTA i tabel 1, viser, at EV-koncentrationen falder under processen på grund af det rensningstrin, der udføres to gange efter mærkning med kolonnen. Den opnåede mængde er imidlertid i det optimale interval af antallet af partikler, der skal bruges til behandling. Denne partikelkoncentration bruges til at beregne mængden ...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Her præsenterer vi en protokol til mærkning blodplade lysat-afledte ekstracellulære vesikler til at overvåge deres migration og optagelse i brusk explants bruges som model for slidgigt.

Mærkning af ekstracellulære vesikler til overvågning af migration og optagelse i brusk explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Denne enkle protokol gør det muligt at mærke elbiler og overvåge dem via konfokal mikroskopi. For eksempel, EV imaging kan hjælpe med at evaluere EV distribution, når du bruger det i therapeutics. Denne teknik gør det muligt at overvåge EV migration og optagelse i brusk explants nemt, med konfokal mikroskopi uden nogen særlig funktion.Den samme protokol kan bruges til elbiler til in vitro- eller in vivo-eksperimenter. Sørg for, at kolonnerne er forberedt på forhånd, og at den oprindelige mængde elbiler er nok til at nå den ønskede endelige partikelkoncentration, i betragtning af at omkring 10% af partiklerne vil gå tabt under rensningstrinnet. Begynd med at koncentrere den ekstracellulære vesikel, eller EV, prøve og kontrol.Prøverne anbringes i et 15 milliliter eller 500 mikroliters koncentrererør, afhængigt af startmængden af EV-prøven. Centrifugere rørene i henhold til producentens anvisninger, indtil der er opnået en næsten tør prøve. Ophæng de koncentrerede EV-prøver med 200 mikroliter og kontrolgruppen med 100 mikroliter fortyndingsstoffer C, og overfør dem til nye 1,5 milliliter centrifugerør.Ev-prøven adskilles i to aliquots af 100 mikroliter hver. Markér en af aliquots med farvestof og bruge det som behandling. Lad den anden være umærket, men behandl den som EV-prøven, og brug den til at kvantificere EV-koncentrationen ved nanopartiklersporingsanalyse.Forbered 2x farveopløsning, således at den resulterende koncentration af PKH26 opløsning i fortyndingsmiddel C er otte mikromolar. Bland en mikroliter af en millimolar PKH26 linker pr. 125 mikroliter fortyndingsstoffer af fortyndings C i prøven. Forbered den mængde, der kræves for at føje til prøverne i et 1:1-forhold.Tilsæt 2x farveopløsning til PKH-blodpladelysafledte elbiler og kontroller prøver i et 1:1-forhold for at opnå 1x farvekoncentration og fire mikromolar PKH26 koncentration. Tilsæt den samme mængde PBS til NTA-blodpladelysetsafledte EV-prøve. Inkuber i fem minutter ved stuetemperatur.Tilføj 5%kvæg serum albumin-PBS opløsning til prøverne i et 1:1-forhold, og sørg for, at det endelige volumen er ca. 400 mikroliter. Fortsæt med at adskille de mærkede elbiler fra de ubundne farvestofinteraktioner og ikke-specifikke farveinteraktioner med kolonnen. Fjern hætten fra kolonnen, tilsæt 400 mikroliter PKH-blodpladelydafledlede elbiler, NTA-blodpladeafledte elbiler, eller kontroller og kassér al eluteret væske.Vent på, at eksemplet kommer helt ind i kolonnen, før du går videre til næste trin. Tilsæt 600 mikroliter PBS og kassér al eluted væske. Vent på, at PBS'en kommer helt ind i kolonnen, før du går videre til næste trin.Tilsæt 600 mikroliter PBS og indsamle en brøkdel af 600 mikroliter i en 1,5-milliliter centrifuge rør. For en ny kolonne gentages de trin, der involverer koncentrationen af de prøver, der er nævnt i begyndelsen af protokollen. Tilføj 600 mikroliter af tidligere eluted elvs til kolonnen og kassere den eluted volumen.Tilsæt derefter 400 mikroliter PBS og kassér alle eluterede mængder. Tilsæt 600 mikroliter PBS til kolonnen og saml en brøkdel af 600 mikroliter i et 1,5 milliliter centrifugerør. Vask brusk to gange med PBS og punktafgifter det ved hjælp af en tre millimeter diameter biopsi punch under sterile forhold.Placer explants i 96-brønd kultur plader med DMEM-F12 medium, suppleret med 1% penicillin streptomycin ved 37 grader Celsius, 5% CO2, og 80% fugtighed. For at etablere en inflammation-drevet OA model, supplere cellekultur medium med 10 nanogram per milliliter oncostatin M og to nanogram per milliliter tumor nekrose faktor-alpha. Behandle explants med 1 gange 10 til 9th partikler pr brønd af PKH blodplade lysat-afledte elbiler, eller kontrol, i celle kultur medium suppleret med oncostatin M og tumor nekrose faktor-alpha.Fjern mediet fra de 96-brønd cellekulturplader, der indeholder brusk explants. Tilføj 200 mikroliter af cellekulturmediet til hver brønd som beskrevet i manuskriptet. Stop in vitro-analysen hver time fra nul til fem timer.Vask cellekulturbjerne, der indeholder brusk explants to gange med 200 mikroliter pbs. Tilsæt 100 mikroliter af 4% paraformaldehyd til vævet for at ordne det i tre timer ved fire grader Celsius. Fjern PFA, tilsæt 100 mikroliter PBS, opbevar det faste væv ved fire grader Celsius, og behandl prøverne inden for 48 timer.Billeder taget på forskellige tidspunkter viser, hvordan elbiler kommer ind i vævet, indtil de når chondrocytterne, og kommer ind i chondrocytterne over tid. De mærkede elbiler var allerede lokaliseret omkring chondrocytter efter en times inkubation. Sørg for, at den oprindelige mængde elbiler er nok til at nå den ønskede endelige partikelkoncentration.En anden vigtig ting at huske er at bruge de mærkede elbiler inden for de næste 24 timer. Hvis det ikke anvendes inden for 24 timer, kan der forekomme et fald i fluorescens. Denne teknik vil hjælpe forskere til at forbedre EV billeddannelse, og at studere elbiler i biologi og terapi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantificering og Størrelse-profilering af ekstracellulær blærer Brug Tunable Resistiv Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papir-baserede enheder til isolering og karakterisering af ekstracellulær Vesikler

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel stillads til Artikulære chondrocyt Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epithelial cellerepopulationskilde og Udarbejdelse af Gnaver ekstracellulær matrix Stilladser for Renal Tissue Udvikling

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregering og bioreaktor Modning til Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Real-time visualisering og analyse af Chondrocyt skade som følge af mekanisk belastning i fuldt intakt Murine brusk Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En menneskelig 3D ekstracellulær matrix-Adipocyte kultur model for at studere matrix-celle metaboliske Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...