Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

इस शोध को इंस्टीट्यूटो डी सालुद कार्लोस III, मिनिस्टरियो डी इकोनी वाई प्रतिस्पर्धी, ईएसएफ यूरोपीय सामाजिक कोष और ईआरडीएफ यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (MS16/00124) द्वारा सह-वित्त पोषित द्वारा वित्त पोषित किया गया था; CP16/00124); प्रोग्रामा जूनियर डेल प्रोयेक्टो टैलेंट प्लस द्वारा, कॉन्स्ट्रयूयेंडो सालुद, जेनेरैंडो वीरता (जूनियर01/18), बेलेरिक द्वीपों के टिकाऊ पर्यटन कर द्वारा वित्तपोषित; Direcció जनरल डी 'Investigació, Conselleria d'Investigació द्वारा, बेलेर (FPI/2046/2017) शासन; FOLIUM पोस्टडॉक्टोरल प्रोग्राम (FOLIUM 17/01) द्वारा FUTURMed के भीतर, बैलेरिक द्वीप समूह के टिकाऊ पर्यटन कर द्वारा 50% पर वित्त पोषित और ESF द्वारा 50% पर; और Comissio de Docencia द्वारा मैं Investigacio डे ला Fundacio Banc de गाया मैं Teixits de les Illes Balears (CDI21/03) ।

नोट: सीईआई-आईबी (आईबी 3656118 पीआई) द्वारा परियोजना के नैतिक अनुमोदन के बाद संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुपालन में IDISBa बायोबैंक (आईबी 1995/12 बायो) से उपास्थि विस्तार प्राप्त किया गया था ।
1. कॉलम तैयारी...

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. 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Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

ईवी इमेजिंग ईवी गुणों को समझने में मदद करता है, जैसे कि उनकी रिहाई और तेज तंत्र। उनकी इमेजिंग उनके बायोडिवीब्यूशन की निगरानी और दवा वाहनों के रूप में उनके फार्माकोकाइनेटिक गुणों के लक्षण वर्णन की अनुम...

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक आर्टिकुलर अपक्षयी रोग है जो एक प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय सूजन और आर्टिकुलर उपास्थि1के बाह्य मैट्रिक्स के विनाश का तात्पर्य है। यद्यपि गठिया के विभिन्न रूपों में कई उपचार हैं2,3,4,ये उनके दुष्प्रभावों और सीमित प्रभावकारिता से प्रतिबंधित हैं। ऑटोलॉगस कोनड्रोसाइट प्रत्यारोपण का उपयोग करने वाली ऊतक इंजीनियरिंग तकनीकों को नियमित रूप से ओए उपास्थि घावों में घायल उपास्थि के पुनर्योजी उपचार के लिए लागू किया जाता है4. सेल-आधारित उपचार मुख्य रूप से सीमित संख्या में फेनोटाइपिक रूप से स्थिर कोनड्रोसाइट्स या चोंड्रोड्रोजेनिटर के कारण प्रतिबंधित होते हैं जो उपास्थि3की प्रभावी रूप से मरम्मत करने में सक्षम होते हैं। इसलिए, रोग प्रगति को रोकने और बड़े उपास्थि घावों को पुनर्जीवित करने के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों का विकास सर्वोपरि महत्व का है।
विभिन्न लेखकों द्वारा ओए के उपचार के रूप में अतिरिक्त कोशिकीय वेसिकल्स (ईवीएस) का सुझाव दिया गया है5,6। ईवीएस अधिकांश कोशिका प्रकारों द्वारा गुप्त किए गए झिल्लीदार निकाय हैं, जो अंतरकोशिकीय संकेत में शामिल होते हैं, और स्टेम सेल के चिकित्सीय प्रभाव7,8, 9को लागू करने के लिए दिखाए गए हैं, जिसके कारण उन्होंने हाल ही में पुनर्योजी दवा10में रुचि प्राप्त की है। मेसेंचिमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) से प्राप्त ईवी ओए के लिए जांच की गई मुख्य चिकित्सीय ईवीएस हैं, हालांकि अन्य संयुक्त-संबंधित कोशिकाओं का उपयोग ईवी स्रोतों के रूप में किया गया है, उदाहरण के लिए, chondroprogenitors या प्रतिरक्षा कोशिकाओं11,12।
प्लेटलेट लिसेट्स (पीएलएस) जैसे प्लेटलेट ध्यान केंद्रित, का उपयोग विभिन्न चोटों में घाव भरने को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जैसे कॉर्नियल अल्सर13,14,15 या टेंडन ऊतक पुनर्जनन16,इस परिकल्पना के कारण कि प्लेटलेट का ईवी घटक इन प्रभावों के लिए जिम्मेदार हो सकता है17 . संयुक्त-संबंधित रोगों से संबंधित कुछ अध्ययनों में प्लेटलेट-व्युत्पन्न ईवीएस (पीएल-ईवीएस) का उपयोग ऑस्टियोआर्थ्रिटिक स्थितियों को सुधारने के लिए उपचार के रूप में किया जाता है। पीएल-ईवीएस ने18डब्ल्यूएनटी/β-कैटेलिन मार्ग को सक्रिय करके, ऑस्टियोआर्थ्रिटिक कोंड्रोसाइट्स19में कोन्ड्रोजेनिक मार्कर की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देकर, या पीएल-ईवीएस18के साथ व्यवहार किए जाने वाले ऑस्टियोआर्ट्रिटिक खरगोशों में कोन्ड्रोजेनिक प्रोटीन के उच्च स्तर और कम टिस्लर असामान्यताओं को दिखाकर, 18 को कम करके, कोंडर्रोसाइटे प्रसार और सेल माइग्रेशन में सुधार किया।
ईवीएस में प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड होते हैं जो लक्ष्य कोशिका से मुक्त होते हैं, सेल-टू-सेल संचार की स्थापना करते हैं, जो उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों से संबंधित मुख्य विशेषता है20। ईवीएस का प्रभाव उनकी पहुंच कोशिकाओं और बाद में कार्गो रिलीज पर निर्भर करता है। इस प्रभाव की पुष्टि अप्रत्यक्ष रूप से कोशिकाओं में होने वाले परिवर्तनों, जैसे मेटाबोलिक गतिविधि या जीन अभिव्यक्ति संशोधन से की जा सकती है । हालांकि, ये विधियां इस दृश्य की अनुमति नहीं देती हैं कि ईवीएस कोशिकाओं तक अपने कार्य को लागू करने के लिए कैसे पहुंचते हैं। इस प्रकार, यह पेपर सूजन-चालित ओए उपास्थि प्रत्यारोपित के उपचार के रूप में उपयोग किए जाने वाले इन पीएल-व्युत्पन्न ईवीएस को लेबल करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग 5 घंटे के समय-चूक में एक्सप्लांट में मौजूद कोन्ड्रोसाइट्स के लिए ईवी तेज और प्रगति की निगरानी के लिए किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) का उपयोग विभिन्न अध्ययनों में प्लेटलेट्स एंसेट (पीएल) जैसे उनके सेलुलर स्रोत से प्राप्त कार्गो के कारण सेल-मुक्त उपचार के रूप में अपनी क्षमता साबित करने के लिए किया जाता है। उपचार के रूप में उपयोग किए जाने पर, ईवी को लक्षित कोशिकाओं में प्रवेश करने और इन से प्रतिक्रिया को प्रभावित करने की उम्मीद है। इस शोध में पीएल-व्युत्पन्न ईवीएस को ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) के लिए सेल-फ्री इलाज के रूप में अध्ययन किया गया है। इस प्रकार, ईवीएस को लेबल करने और उपास्थि एक्सप्लांट पर उनके तेज का परीक्षण करने के लिए एक विधि स्थापित की गई थी। पीएल-व्युत्पन्न ईवीएस को लिपोफिलिक डाई पीके26 के साथ लेबल किया जाता है, जो एक कॉलम के माध्यम से दो बार धोया जाता है, और फिर नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) द्वारा कण मात्राकरण के बाद 5 घंटे के लिए इन विट्रो सूजन-संचालित ओए मॉडल में परीक्षण किया जाता है। प्रति घंटा, उपास्थि प्रत्यारोपण तय कर रहे हैं, पैराफ़िन, स्लाइड पर माउंट करने के लिए 6 माइक्रोन वर्गों में कटौती, और एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत मनाया । यह इस अवधि के दौरान लक्षित कोशिकाओं (chondrocytes) में प्रवेश करता है या नहीं, इसके सत्यापन की अनुमति देता है और उनके प्रत्यक्ष प्रभाव का विश्लेषण करता है।

ईवीएस लेबलिंग और तेज निगरानी के लिए एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1में प्रदर्शित किया जाता है । तालिका 1 में एनटीए द्वारा पता लगाया गया कण एकाग्रता और ईवी आकार दिखाता है कि कॉलम के साथ ...

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Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

यहां, हम ऑस्टियोआर्थराइटिस के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने वाले उपास्थि प्रत्यारोपण में उनके प्रवास और तेज की निगरानी करने के लिए प्लेटलेट lysate-व्युत्पन्न बाहेल वेसिकल्स लेबल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

उपास्थि एक्सप्लांट्स में माइग्रेशन और तेज की निगरानी के लिए एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की लेबलिंग

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

यह सरल प्रोटोकॉल ईवीएस को लेबल करने और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उनकी निगरानी करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, ईवी इमेजिंग चिकित्सा में इसका उपयोग करते समय ईवी वितरण का मूल्यांकन करने में मदद कर सकता है। यह तकनीक बिना किसी विशेष कार्य के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ ईवी माइग्रेशन की निगरानी करने और आसानी से उपास्थि एक्सप्लांट में तेज करने की अनुमति देती है।एक ही प्रोटोकॉल में विट्रो के लिए या वीवो प्रयोगों में EVs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि कॉलम पहले से तैयार किए जाते हैं, और यह कि ईवीएस की प्रारंभिक मात्रा वांछित अंतिम कण एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है, यह देखते हुए कि शुद्धिकरण चरण के दौरान लगभग 10% कण खो जाएंगे। एक्सट्रासेलुलर वेसिकल, या ईवी, नमूना और नियंत्रण को ध्यान में रखकर शुरू करें।ईवी नमूने की शुरुआती मात्रा के आधार पर नमूनों को 15 मिलीलीटर या 500 माइक्रोलीटर ध्यान केंद्रित करने वाली ट्यूब में रखें। लगभग शुष्क नमूना प्राप्त होने तक निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। 200 माइक्रोलीटर के साथ केंद्रित ईवी नमूनों को फिर से निलंबित करें, और नियंत्रण समूह 100 माइक्रोलीटर के साथ पतला सी, और उन्हें नए 1.5-मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।ईवी नमूने को 100 माइक्रोलीटर के दो एलिकोट्स में अलग करें। डाई के साथ एलिकोट्स में से एक को चिह्नित करें और इसे उपचार के रूप में उपयोग करें। अन्य अचिह्नित छोड़ दें, लेकिन इसे ईवी नमूने की तरह संसाधित करें, और इसका उपयोग नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा ईवी एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए करें।2x डाई समाधान तैयार करें ताकि मंद सी में PKH26 समाधान की परिणामी एकाग्रता आठ माइक्रोमोलर हो। नमूने में डिलुएंट सी के 125 माइक्रोलीटर प्रति एक मिलीमोलर PKH26 लिंकर का एक माइक्रोलीटर मिलाएं। 1:1 अनुपात में नमूनों में जोड़ने के लिए आवश्यक मात्रा तैयार करें।1x डाई एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, पीकेएच प्लेटलेट-व्युत्पन्न ईवीएस और नियंत्रण नमूनों में 1x डाई एकाग्रता, और चार माइक्रोमोलर पीके26 एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 2x डाई समाधान जोड़ें। पीबीएस की इसी मात्रा को एनटीए प्लेटलेट-व्युत्पन्न ईवी सैंपल में डालें। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट।1:1 अनुपात में नमूनों में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन-पीबीएस समाधान जोड़ें, और यह सुनिश्चित करें कि अंतिम मात्रा लगभग 400 माइक्रोलीटर है। कॉलम के साथ अनिर्मित डाई और गैर-विशिष्ट डाई इंटरैक्शन से लेबल किए गए ईवीएस को अलग करने के लिए आगे बढ़ें। कॉलम से कैप निकालें, पीकेएच प्लेटलेट के 400 माइक्रोलीटर व्युत्पन्न ईवीएस, एनटीए प्लेटलेट lysate-व्युत्पन्न ईवीएस, या नियंत्रण और सभी eluted तरल त्यागना जोड़ें।अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से कॉलम में प्रवेश करने के लिए नमूना की प्रतीक्षा करें। पीबीएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और सभी eluted तरल त्यागें। अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले पीबीएस को पूरी तरह से कॉलम दर्ज करने की प्रतीक्षा करें।पीबीएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में 600 माइक्रोलीटर का एक अंश एकत्र करें। एक नए कॉलम के लिए, प्रोटोकॉल की शुरुआत में उल्लिखित नमूनों की एकाग्रता से जुड़े चरणों को दोहराएं। कॉलम में पहले से एल्यूटेड ईवीएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और एलुयूटेड वॉल्यूम को त्यागें।फिर पीबीएस के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और सभी eluted संस्करणों को त्यागें। कॉलम में पीबीएस के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में 600 माइक्रोलीटर का एक अंश एकत्र करें। उपास्थि को पीबीएस के साथ दो बार धोएं और बाँझ परिस्थितियों में तीन मिलीमीटर व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग करके इसे उत्पादित करें।डीएमईएम-एफ 12 माध्यम के साथ 96-अच्छी संस्कृति प्लेटों में एक्सप्लांट रखें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 80% आर्द्रता पर 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। सूजन-संचालित ओए मॉडल स्थापित करने के लिए, ऑनकोस्टिन एम के 10 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा के दो नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ सेल संस्कृति माध्यम का पूरक करें। एक्सप्लांट्स को 1 गुना 10 से 9 कणों के साथ इलाज करें PKH प्लेटलेट लाइसेट-व्युत्पन्न ईवीएस, या नियंत्रण, सेल कल्चर मीडियम में ओन्कोस्टिन एम और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा के साथ पूरक।उपास्थि एक्सप्लांट युक्त 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों से माध्यम निकालें। पांडुलिपि में वर्णित प्रत्येक के लिए सेल संस्कृति माध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। शून्य से पांच घंटे तक हर घंटे इन विट्रो परख बंद करो।पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर के साथ दो बार उपास्थि विस्तार से युक्त सेल संस्कृति कुओं को धोएं। ऊतक में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें ताकि इसे चार डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए ठीक किया जा सके। पीएफए निकालें, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, तय टिश्यू को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और 48 घंटे के भीतर नमूनों को संसाधित करें।विभिन्न समय बिंदुओं पर ली गई छवियां बताती हैं कि ईवीएस ऊतक में कैसे प्रवेश करते हैं जब तक कि वे chondrocytes तक नहीं पहुंच जाते हैं, और समय के साथ chondrocytes दर्ज करते हैं। लेबल EVs पहले से ही इनक्यूबेशन के एक घंटे के बाद chondrocytes के आसपास स्थानीयकृत थे । सुनिश्चित करें कि ईवीएस की प्रारंभिक मात्रा वांछित अंतिम कण एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पर्याप्त है।याद रखने वाली एक और महत्वपूर्ण बात यह है कि अगले 24 घंटों के भीतर लेबल वाले ईवीएस का उपयोग करें। यदि 24 घंटे के भीतर इसका उपयोग नहीं किया जाता है, तो फ्लोरेसेंस में कमी हो सकती है। इस तकनीक से शोधकर्ताओं को ईवी इमेजिंग में सुधार करने और जीव विज्ञान और चिकित्सा विज्ञान में ईवीएस का अध्ययन करने में मदद मिलेगी ।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

गैर संपर्क, सेल और बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करते हुए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का लेबल मुक्त निगरानी

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

मास Cytometry: दैनिक और एक CyTOF मास cytometer पर ट्यूनिंग रनिंग सेल के नमूने के लिए प्रोटोकॉल

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

मात्रा का ठहराव और tunable प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग का उपयोग कोशिकी vesicles के आकार की रूपरेखा

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

कोशिकी vesicles के अलगाव और विशेषता के लिए कागज आधारित उपकरणों

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

जोड़ उपास्थिकोशिका संस्कृति और उपास्थि पीढ़ी के लिए 3 डी हाइड्रोजेल Scaffolds

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

उपकला सेल repopulation और गुर्दे ऊतकों के विकास के लिए कृंतक बाह्य मैट्रिक्स scaffolds के तैयारी

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3 डी चुंबकीय स्टेम सेल एकत्रीकरण और बायोरिएक्टर परिपक्वता उपास्थि उत्थान के लिए

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

वास्तविक समय दृश्य और पूरी तरह से बरकरार Murine उपास्थि Explants में यांत्रिक लदान के कारण Chondrocyte चोट का विश्लेषण

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

बाह्य पुटिका के भंडारण स्थिरता का मूल्यांकन

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

मैट्रिक्स-सेल मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए एक मानव 3 डी एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स-एडिपोसाइट संस्कृति मॉडल

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...