Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, finansiert av ESF European Social Fund og ERDF European Regional Development Fund (MS16/00124; CP16/00124); av PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansiert av den bærekraftige turistskatten på Balearene; av Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); av FOLIUM postdoktorprogram (FOLIUM 17/01) innenfor FUTURMed, finansiert til 50% av den bærekraftige turistskatten på Balearene og på 50% av ESF; og av Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

MERK: Bruskutløp ble hentet fra IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) i samsvar med institusjonelle retningslinjer etter etisk godkjenning av prosjektet av CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Kolonne forberedelse
<ol><li>Likevektskolonner etter produsentens instruksjoner eller som følger:<ol>
<li>Fjern kolonnehetten og likevekt kolonnen. Fjern lagringsbufferen ved elution.</li>
		<li>Vask kolonnen 3 ganger med 2,5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Under hver vask, vent til kolonnen absorberer hele volumet....

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions.">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis.">et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression.">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury.">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li><li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair.">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis:+a+systematic+review.">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).</li><li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions.">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li><li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response.">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).</li><li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy.">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).</li><li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA,+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment.">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li><li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes.">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).</li><li>de Miguel P&#233;rez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis,+intracellular+sorting,+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells.">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis.">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extracellular+vesicles:+Current+and+emerging+methods.">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li><li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry.">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

EV-avbildning bidrar til å forstå EV-egenskaper, for eksempel frigjørings- og opptaksmekanismer. Deres bildebehandling tillater overvåking av deres biodistribusjon og karakterisering av deres farmakokinetiske egenskaper som narkotikakjøretøy. Imidlertid kan EV-bildebehandling og sporing være vanskelig på grunn av deres små størrelser, selv om mange bildeenheter og merkingsteknikker er utviklet for å hjelpe forskere med å overvåke ELBILER under in vitro- og in vivo-forhold ...

Artikulær degenerativ sykdom som innebærer en progressiv og irreversibel betennelse og ødeleggelse av den ekstracellulære matrisen til leddbrusk1. Selv om ulike former for leddgikt har mange behandlinger2,3,4, disse er begrenset av deres bivirkninger og begrenset effekt. Vevsteknikksteknikker ved hjelp av autolog kondrocyttimplantasjon brukes rutinemessig til regenerativ behandling av skadet brusk i tidlig OA brusk lesjoner4. Cellebaserte terapier er begrenset hovedsakelig på grunn av det begrensede antallet fenotypisk stabile kondrocytter eller kondroprogenitorer som er i stand til effektivt å reparere brusk3. Derfor er utviklingen av nye terapeutiske strategier for å forhindre sykdomsprogresjon og regenerere store bruskskader av avgjørende betydning.
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) har blitt foreslått som en behandling for OA av forskjellige forfattere5,6. Elbiler er membranøse organer utskilt av de fleste celletyper, er involvert i intercellulær signalering, og har vist seg å utøve stamcellers terapeutiske effekter7,8,9, som de nylig har fremkalt interesse for regenerativ medisin10. ELBILER avledet fra mesenchymale stromale celler (MSCer) er de viktigste terapeutiske ELBIL-ene som undersøkes for OA, selv om andre leddrelaterte celler har blitt brukt som EV-kilder, for eksempel kondroprogenitorer eller immunceller11,12.
Blodplatekonsentrater, som blodplatelysater (PLs), brukes til å forbedre sårheling i forskjellige skader, for eksempel hornhinnensår13,14,15 eller i regenerering av senervev16, på grunn av hypotesen om at EV-komponenten av blodplatekonsentrater kan være ansvarlig for disse effektene17 . Noen studier relatert til leddrelaterte sykdommer bruker blodplaterette-avledede elbiler (PL-elbiler) som behandling for å forbedre osteoarthritiske tilstander. PL-ELBILER forbedrer kondrocyttproliferasjon og cellemigrasjon ved å aktivere Wnt / β-catenin-banen18, fremme uttrykket av kondrogene markører i osteoarthritic kondrocytter19, eller vise høyere nivåer av kondrogene proteiner og færre tissulære abnormiteter hos osteoarthritic kaniner behandlet med PL-EVs18.
Elbiler inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer som frigjøres til målcellen, og etablerer celle-til-celle-kommunikasjon, som er hovedfunksjonen relatert til deres terapeutiske applikasjoner20. Effektene av elbiler avhenger av deres rekkeviddeceller og påfølgende lastfrigjøring. Denne effekten kan bekreftes indirekte av endringer forårsaket i celler, for eksempel metabolsk aktivitet eller genuttrykksmodifisering. Disse metodene tillater imidlertid ikke visualisering av hvordan elbiler når celler for å utøve sin funksjon. Dermed presenterer dette papiret en metode for å merke disse PL-avledede ELBIL-ene som skal brukes som behandling for betennelsesdrevne OA-bruskutløp. Konfokal mikroskopi ble brukt til å overvåke EV-opptak og progresjon til kondrocyttene som er tilstede i eksplantene i et tidsforløp på 5 timer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) brukes i forskjellige studier for å bevise sitt potensial som en cellefri behandling på grunn av deres last avledet fra deres cellulære kilde, for eksempel blodplatelysat (PL). Når elbiler brukes som behandling, forventes det at de kommer inn i målcellene og påvirker et svar fra disse. I denne forskningen har PL-avledede elbiler blitt studert som en cellefri behandling for slitasjegikt (OA). Dermed ble det satt opp en metode for å merke elbiler og teste opptaket på bruskutløp. PL-avledede elbiler er merket med det lipofile fargestoffet PKH26, vaskes to ganger gjennom en kolonne, og testes deretter i en in vitro-betennelsesdrevet OA-modell i 5 timer etter partikkel kvantifisering ved nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Hver time er bruskutløp faste, paraffinerte, kuttet i 6 μm seksjoner for å montere på lysbilder, og observeres under et konfokalt mikroskop. Dette gjør det mulig å verifisere om elbiler kommer inn i målcellene (kondrocytter) i denne perioden og analyserer deres direkte effekt.

En skjematisk oversikt over EV-merking og opptaksovervåking vises i figur 1. Partikkelkonsentrasjonen og EV-størrelsen som NTA har oppdaget i tabell 1, viser at EV-konsentrasjonen reduseres under prosessen på grunn av rensetrinnet som utføres to ganger etter merking med kolonnen. Mengden oppnådd er imidlertid i det optimale spekteret av antall partikler som skal brukes til behandling. Denne partikkelkonsentrasjonen brukes til å beregne volumet av PKH-PL-EV og kontroll ...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Her presenterer vi en protokoll for å merke blodplater lysate-avledede ekstracellulære vesikler for å overvåke deres migrasjon og opptak i bruskutløp som brukes som modell for slitasjegikt.

Merking av ekstracellulære vesicles for overvåking av migrasjon og opptak i bruskutløp

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Denne enkle protokollen gjør det mulig for en å merke elbiler og overvåke dem via konfikal mikroskopi. For eksempel kan EV-avbildning hjelpe til med å evaluere EV-distribusjon når du bruker den i terapeutiske behandlinger. Denne teknikken gjør det enkelt å overvåke EV-migrering og opptak i bruskekster, med konfektmikroskopi uten noen spesiell funksjon.Den samme protokollen kan brukes til elbiler for in vitro- eller in vivo-eksperimenter. Forsikre deg om at kolonnene er forberedt på forhånd, og at det første volumet av elbiler er nok til å nå ønsket endelig partikkelkonsentrasjon, med tanke på at rundt 10% av partiklene vil gå tapt under rensetrinnet. Begynn med å konsentrere den ekstracellulære vesicle, eller EV, prøven og kontrollen.Plasser prøvene i et konsentrerende rør på 15 milliliter eller 500 mikroliter, avhengig av startvolumet til EV-prøven. Sentrifuger rørene i henhold til produsentens instruksjoner til en nesten tørr prøve er oppnådd. Re-suspendere de konsentrerte EV-prøvene med 200 mikroliter, og kontrollgruppen med 100 mikroliter for fortynnings C, og overfør dem til nye 1,5 milliliter sentrifugerør.Del EV-prøven i to aliquots på 100 mikroliter hver. Merk en av aliquots med fargestoff og bruk den som behandling. La den andre være umerket, men behandle den som EV-prøven, og bruk den til å kvantifisere EV-konsentrasjonen ved nanopartikkelsporingsanalyse.Forbered 2x fargestoffløsning slik at den resulterende konsentrasjonen av PKH26-oppløsning i fortynningsmiddel C er åtte mikromolar. Bland en mikroliter av en millimolar PKH26 linker per 125 mikroliter av fortynnings C i prøven. Klargjør volumet som kreves for å legge til prøvene i et 1:1-forhold.Tilsett 2x fargestoffløsning til PKH-blodplatelyse-avledede elbiler og kontrollprøver i et 1:1-forhold, for å oppnå 1x fargekonsentrasjon og fire mikromolar PKH26-konsentrasjon. Tilsett samme volum PBS i NTA-blodplatelysatavledede EV-prøver. Inkuber i fem minutter ved romtemperatur.Legg til 5%bovint serumalbumin-PBS-løsning i prøvene i et 1:1-forhold, og sørg for at det endelige volumet er omtrent 400 mikroliter. Fortsett å skille de merkede ELBIL-ene fra ubundet fargestoff og ikke-spesifikke fargeinteraksjoner med kolonnen. Fjern hetten fra søylen, tilsett 400 mikroliter PKH-blodplatelysledede elbiler, NTA-blodplatelysavledede elbiler, eller kontroller og kast all utvunnet væske.Vent til eksemplet går helt inn i kolonnen før du går videre til neste trinn. Tilsett 600 mikroliter PBS og kast all unndratt væske. Vent til PBS-en går helt inn i kolonnen før du går videre til neste trinn.Tilsett 600 mikroliter PBS og samle en brøkdel av 600 mikroliter i et sentrifugerør på 1,5 milliliter. For en ny kolonne gjentar du trinnene som involverer konsentrasjonen av prøvene som er nevnt i begynnelsen av protokollen. Tilsett 600 mikroliter tidligere eluterte elbiler i kolonnen og kast det eluterte volumet.Tilsett deretter 400 mikroliter PBS og kast alle eluterte volumer. Tilsett 600 mikroliter PBS i kolonnen og samle en brøkdel av 600 mikroliter i et sentrifugerør på 1,5 milliliter. Vask brusk to ganger med PBS og sluk den ved hjelp av en biopsistans med tre millimeter diameter under sterile forhold.Plasser utløpene i 96-brønns kulturplater med DMEM-F12 medium, supplert med 1% penicillin streptomycin ved 37 grader Celsius, 5% CO2 og 80% fuktighet. For å etablere en betennelsesdrevet OA-modell, supplere cellekulturmediet med 10 nanogram per milliliter onkostatin M og to nanogram per milliliter tumornekrosefaktor-alfa. Behandle eksplantene med 1 ganger 10 til 9. partikler per brønn av PKH-blodplatelyse-avledede elbiler, eller kontroll, i cellekulturmedium supplert med onkostatin M og tumornekrosefaktor-alfa.Fjern mediet fra de 96-brønns cellekulturplatene som inneholder bruskutløp. Tilsett 200 mikroliter av cellekulturmediet til hver brønn som beskrevet i manuskriptet. Stopp in vitro-analysen hver time fra null til fem timer.Vask cellekulturbrønnene som inneholder brusk utviser to ganger med 200 mikroliter PBS. Tilsett 100 mikroliter 4% paraformaldehyd i vevet for å fikse det i tre timer ved fire grader Celsius. Fjern PFA, tilsett 100 mikroliter PBS, lagre det faste vevet ved fire grader Celsius, og behandle prøvene innen 48 timer.Bilder tatt på forskjellige tidspunkter viser hvordan elbiler kommer inn i vevet til de når kondrocyttene, og går inn i kondrocyttene over tid. De merkede ELBIL-ene var allerede lokalisert rundt kondrocytter etter en times inkubasjon. Forsikre deg om at det første volumet av elbiler er nok til å nå ønsket endelig partikkelkonsentrasjon.En annen viktig ting å huske er å bruke de merkede ELBIL-ene i løpet av de neste 24 timene. Hvis du ikke bruker den innen 24 timer, kan det oppstå en reduksjon i fluorescens. Denne teknikken vil hjelpe forskere med å forbedre EV-avbildning, og å studere elbiler i biologi og terapeutisk behandling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass cytometri: Protokoll for Daily Tuning og kjører celleprøver på en CyTOF Mass cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantifisering og Size-profilering av Ekstracellulær Blemmer Bruke Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papirbaserte Enheter for isolering og karakterisering av Ekstracellulær Blemmer

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel Stillas for Ledd chondrocyttransplantasjon Kultur og brusk Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitelcelle repopulation og klargjøring av gnagere Ekstracellulær Matrix Stillas for Nedsatt Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Magnetisk Stem Cell Aggregation og bioreaktor Modning for Brusk Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Sanntids visualisering og analyse av Chondrocyte personskader mekaniske belastninger i fullt intakt Murine brusk Explants

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluering av lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...