Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124); pelo PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares; pelo Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); pelo programa de pós-doutorado FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro do FUTURMed, financiado em 50% pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares e em 50% pela ESF; e pelo Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparação da coluna
<ol><li>Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:<ol>
<li>Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.</li>
		<li>Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com f...

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions.">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis.">et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression.">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury.">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li><li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair.">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis:+a+systematic+review.">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).</li><li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions.">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li><li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response.">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).</li><li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy.">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).</li><li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes.">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).</li><li>de Miguel P&#233;rez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis,+intracellular+sorting,+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells.">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis.">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extracellular+vesicles:+Current+and+emerging+methods.">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li><li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry.">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo...

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular1. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA4. As terapias baseadas em células são restritas principalmente devido ao número limitado de condrócitos fenotipicamente estáveis ou chondroprogenitors capazes de reparar efetivamente a cartilagem3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da doença e regenerar grandes lesões de cartilagem é de suma importância.
Vesículos extracelulares (EVs) têm sido sugeridos como um tratamento para OA por diferentes autores5,6. Os EVs são corpos membranous secretados pela maioria dos tipos de células, estão envolvidos na sinalização intercelular, e têm sido mostrados para exercer os efeitos terapêuticos das células-tronco7,8,9, devido ao qual recentemente despertaram interesse em medicina regenerativa10. Os EVs derivados de células estromais mesenquimais (MSCs) são os principais EVs terapêuticos investigados para OA, embora outras células relacionadas à articulação tenham sido usadas como fontes de EV, por exemplo, condroprogenitors ou células imunes11,12.
Concentrados plaquetas, como plaquetas plaquetas (PLs), são usados para melhorar a cicatrização de feridas em diferentes lesões, como úlceras córneas13,14,15 ou na regeneração do tecido tendinoso16,devido à hipótese de que o componente EV dos concentrados plaquetas pode ser responsável por esses efeitos17 . Alguns estudos relacionados a doenças relacionadas à articulação utilizam EVs derivados de plaquetas (PL-EVs) como tratamento para amenizar as condições osteoartríticas. Os PL-EVs melhoram a proliferação de condrocitos e a migração celular ativando a via Wnt/β-catenin18, promovendo a expressão de marcadores condrogênicos em condrócitos osteoartréticos19, ou mostrando níveis mais elevados de proteínas condrogênicas e menos anormalidades tissulares em coelhos osteoartrrápticos tratados com PL-EVs18.
Os EVs contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que são liberados para a célula-alvo, estabelecendo a comunicação célula-célula, que é a principal característica relacionada às suas aplicações terapêuticas20. Os efeitos dos EVs dependem de suas células de alcance e posterior liberação de carga. Esse efeito pode ser confirmado indiretamente por alterações causadas nas células, como atividade metabólica ou modificação da expressão genética. No entanto, esses métodos não permitem a visualização de como os EVs chegam às células para exercer sua função. Assim, este artigo apresenta um método para rotular esses EVs derivados de PL para serem utilizados como tratamento para explantas de cartilagem OA orientadas por inflamação. A microscopia confocal foi utilizada para monitorar a absorção e progressão de EV para os condrócitos presentes nas explantas em um lapso de tempo de 5h.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.

Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas ?...

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Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Este protocolo simples permite rotular EVs e monitorá-los através de microscopia confocal. Por exemplo, a imagem EV pode ajudar na avaliação da distribuição de EV ao usá-la na terapêutica. Esta técnica permite monitorar a migração e a absorção de EV facilmente em explants de cartilagem, com microscopia confocal sem qualquer função especial.O mesmo protocolo pode ser usado para EVs para experimentos in vitro ou in vivo. Certifique-se de que as colunas sejam preparadas com antecedência, e que o volume inicial de EVs seja suficiente para atingir a concentração final de partículas desejada, considerando que cerca de 10% das partículas serão perdidas durante a etapa de purificação. Comece concentrando a vesícula extracelular, ou EV, amostra e o controle.Coloque as amostras em um tubo concentrador de 15 mililitros ou 500 microliters, dependendo do volume inicial da amostra de EV. Centrifugar os tubos de acordo com as instruções do fabricante até que uma amostra quase seca seja obtida. Suspenda as amostras concentradas de EV com 200 microlitres, e o grupo controle com 100 microlitres de C diluído, e transfira-as para novos tubos de centrífugas de 1,5 mililitro.Separe a amostra de EV em duas alíquotas de 100 microliters cada. Marque uma das alíquotas com corante e use-a como tratamento. Deixe o outro sem identificação, mas processe-o como a amostra EV, e use-a para quantificar a concentração de EV por análise de rastreamento de nanopartículas.Prepare a solução de corante 2x de modo que a concentração resultante da solução PKH26 em C diluído seja de oito micromolar. Misture um microliter de um divisor PKH26 por 125 microlitres de C diluído na amostra. Prepare o volume necessário para adicionar às amostras em uma proporção de 1:1.Adicione a solução de corante 2x aos EVs derivados de plaquetas PKH e controle amostras em uma proporção de 1:1, para atingir 1x de concentração de corante, e quatro concentrações de PKH26 micromolar. Adicione o mesmo volume de PBS à amostra de EV derivada da plaqueta NTA. Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.Adicione 5% de solução de albumina-PBS de soro bovino às amostras em uma proporção de 1:1, e certifique-se de que o volume final seja de aproximadamente 400 microliters. Prossiga para separar os EVs rotulados das interações de corante não vinculado e corante não específico com a coluna. Remova a tampa da coluna, adicione 400 microliters de EVs derivados de plaquetas PKH, EVs derivados de plaquetas NTA ou controle e descarte todo o líquido elucido.Aguarde que a amostra entre completamente na coluna antes de prosseguir para o próximo passo. Adicione 600 microliters de PBS e descarte todo o líquido elucido. Aguarde que o PBS entre completamente na coluna antes de prosseguir para a próxima etapa.Adicione 600 microliters de PBS e colete uma fração de 600 microliters em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Para uma nova coluna, repita as etapas envolvendo a concentração das amostras mencionadas no início do protocolo. Adicione 600 microliters de EVs previamente elucidos à coluna e descarte o volume elucido.Em seguida, adicione 400 microliters de PBS e descarte todos os volumes elucidos. Adicione 600 microliters de PBS à coluna e colete uma fração de 600 microliters em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Lave a cartilagem duas vezes com PBS e extive-a usando um soco de biópsia de três milímetros de diâmetro em condições estéreis.Coloque as explantas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEM-F12, suplementada com estreptomicina de penicilina de 1%a 37 graus Celsius, 5%CO2 e 80% de umidade. Para estabelecer um modelo de OA orientado pela inflamação, suplementar o meio de cultura celular com 10 nanogramas por mililitro de oncostatina M e dois nanogramas por mililitro de fator de necrose tumoral-alfa. Trate as explantas com 1 vezes 10 a 900 por poço de EVs derivados de plaquetas PKH, ou controle, em meio de cultura celular suplementado com oncostatina M e fator de necrose tumoral-alfa.Remova o meio das placas de cultura celular de 96 poços contendo explants de cartilagem. Adicione 200 microliters do meio de cultura celular a cada poço descrito no manuscrito. Pare o ensaio in vitro a cada hora de zero a cinco horas.Lave os poços de cultura celular contendo as explantas de cartilagem duas vezes com 200 microliters de PBS. Adicione 100 microlitadores de 4%de paraformaldeído ao tecido para corrigi-lo por três horas a quatro graus Celsius. Remova o PFA, adicione 100 microliters de PBS, armazene o tecido fixo a quatro graus Celsius e processe as amostras dentro de 48 horas.Imagens tiradas em diferentes pontos de tempo mostram como os EVs entram no tecido até chegarem aos condrócitos, e entram nos condrócitos ao longo do tempo. Os EVs rotulados já estavam localizados em torno de condrócitos após uma hora de incubação. Certifique-se de que o volume inicial de EVs é suficiente para atingir a concentração final de partículas desejada.Outra coisa importante a se lembrar é usar os EVs rotulados nas próximas 24 horas. Se não usá-lo dentro de 24 horas, pode ocorrer uma diminuição da fluorescência. Essa técnica ajudará os pesquisadores a melhorar a imagem EV e a estudar EVs em biologia e terapêutica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Bioengenharia

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Quantificação e Tamanho-profiling de vesículas extracelulares Usando Sintonizável resistiva Pulso Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...