Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciada por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (MS16/00124; CP16/00124); por el PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares; por la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); por el programa postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro de la FUTURMed, financiado al 50% por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares y al 50% por el FSE; y por el Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

NOTA: Los explantes de cartílago se obtuvieron del Biobanco IdISBa (IB 1995/12 BIO) de conformidad con las directrices institucionales tras la aprobación ética del proyecto por parte del CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Preparación de la columna
<ol><li>Equilibre las columnas siguiendo las instrucciones del fabricante o de la siguiente manera:<ol>
<li>Retire la tapa de la columna y equilibre la columna. Elimine el búfer de almacenamiento por elución.</li>
		<li>Lave la columna 3 veces con 2,...

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions.">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis.">et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression.">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury.">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li><li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair.">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis:+a+systematic+review.">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).</li><li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions.">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li><li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response.">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes.">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).</li><li>de Miguel P&#233;rez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis,+intracellular+sorting,+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells.">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis.">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li><li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry.">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

Las imágenes EV ayudan a comprender las propiedades ev, como sus mecanismos de liberación y absorción. Su imagen permite el seguimiento de su biodistribución y la caracterización de sus propiedades farmacocinéticas como vehículos farmacológicos. Sin embargo, las imágenes y el seguimiento de EV pueden ser difíciles debido a sus pequeños tamaños, aunque se han desarrollado muchos dispositivos de imágenes y técnicas de etiquetado para ayudar a los investigadores a monitorear los EV en condiciones in vitro<...

La artrosis (OA) es una enfermedad articular degenerativa que implica una inflamación y destrucción progresiva e irreversible de la matriz extracelular del cartílago articular1. Aunque varias formas de artritis tienen numerosos tratamientos2,3,4,estos están restringidos por sus efectos secundarios y eficacia limitada. Las técnicas de ingeniería tisular que utilizan la implantación autóloga de condrocitos se aplican rutinariamente para el tratamiento regenerativo del cartílago lesionado en lesiones tempranas de cartílago OA4. Las terapias basadas en células están restringidas principalmente debido al número limitado de condrocitos fenotípicamente estables o condroprogenitores capaces de reparar eficazmente el cartílago3. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la progresión de la enfermedad y regenerar grandes lesiones de cartílago es de suma importancia.
Las vesículas extracelulares (EV) han sido sugeridas como tratamiento para la OA por diferentes autores5,6. Los EV son cuerpos membranosos secretados por la mayoría de los tipos de células, están involucrados en la señalización intercelular y se ha demostrado que ejercen los efectos terapéuticos de las células madre7,8,9, debido a lo cual recientemente han despertado interés en la medicina regenerativa10. Los EV derivados de células estromales mesenquimales (MSC) son los principales EV terapéuticos investigados para la OA, aunque se han utilizado otras células relacionadas con las articulaciones como fuentes de EV, por ejemplo, condroprogenitores o células inmunes11,12.
Los concentrados plaquetarios, como los lisados plaquetarios (PL), se utilizan para potenciar la cicatrización de heridas en diferentes lesiones, como las úlceras corneales13,14, 15 o en la regeneración del tejido tendinoso16,debido a la hipótesis de que el componente EV de los concentrados plaquetarios puede ser responsable de estos efectos17 . Algunos estudios relacionados con enfermedades relacionadas con las articulaciones utilizan EV derivados de plaquetas (PL-EV) como tratamiento para mejorar las afecciones osteoartríticas. Los PL-EV mejoran la proliferación de condrocitos y la migración celular activando la vía Wnt/β-catenina18,promoviendo la expresión de marcadores condrogénicos en condrocitos osteoartríticos19,o mostrando mayores niveles de proteínas condrogénicas y menos anomalías tisulares en conejos osteoartríticos tratados con PL-EV18.
Los EV contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos que se liberan a la célula diana, estableciendo la comunicación célula a célula, que es la principal característica relacionada con sus aplicaciones terapéuticas20. Los efectos de los vehículos eléctricos dependen de sus células de alcance y posterior liberación de carga. Este efecto puede confirmarse indirectamente por cambios causados en las células, como la actividad metabólica o la modificación de la expresión génica. Sin embargo, estos métodos no permiten la visualización de cómo los EV llegan a las células para ejercer su función. Por lo tanto, este documento presenta un método para etiquetar estos EV derivados de PL para ser utilizados como tratamiento para explantes de cartílago de OA impulsados por la inflamación. Se utilizó microscopía confocal para monitorizar la captación de EV y la progresión a los condrocitos presentes en los explantes en un lapso de tiempo de 5 h.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

Las vesículas extracelulares (EV) se utilizan en diferentes estudios para demostrar su potencial como tratamiento libre de células debido a su carga derivada de su fuente celular, como el lisado plaquetario (PL). Cuando se usan como tratamiento, se espera que los EV ingresen a las células diana y efectúen una respuesta a partir de estas. En esta investigación, los EV derivados de PL se han estudiado como un tratamiento libre de células para la osteoartritis (OA). Por lo tanto, se estableció un método para etiquetar los EV y probar su absorción en los explantes de cartílago. Los EV derivados de PL se etiquetan con el tinte lipofílico PKH26, se lavan dos veces a través de una columna y luego se prueban en un modelo de OA impulsado por inflamación in vitro durante 5 h después de la cuantificación de partículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Cada hora, los explantes de cartílago se fijan, se parafinan, se cortan en secciones de 6 μm para montar en portaobjetos y se observan bajo un microscopio confocal. Esto permite verificar si los EV ingresan a las células diana (condrocitos) durante este período y analizar su efecto directo.

En la Figura 1se muestra una descripción general esquemática para el etiquetado de vehículos eléctricos y el monitoreo de la absorción. La concentración de partículas y el tamaño de EV detectados por NTA en la Tabla 1 muestran que la concentración de EV disminuye durante el proceso debido al paso de purificación realizado dos veces después del etiquetado con la columna. Sin embargo, la cantidad obtenida está en el rango óptimo del número de partículas a utiliz...

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Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Aquí, presentamos un protocolo para etiquetar las vesículas extracelulares derivadas del lisado plaquetario para monitorear su migración y absorción en los explantes de cartílago utilizados como modelo para la osteoartritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Este protocolo simple permite etiquetar los vehículos eléctricos y monitorearlos a través de microscopía confocal. Por ejemplo, las imágenes EV podrían ayudar a evaluar la distribución EV cuando se usan en terapias. Esta técnica permite monitorear la migración y absorción de EV en los explantes de cartílago fácilmente, con microscopía confocal sin ninguna función especial.El mismo protocolo se puede utilizar para vehículos eléctricos para experimentos in vitro o in vivo. Asegúrese de que las columnas estén preparadas de antemano y que el volumen inicial de vehículos eléctricos sea suficiente para alcanzar la concentración final de partículas deseada, teniendo en cuenta que alrededor del 10% de las partículas se perderán durante el paso de purificación. Comience concentrando la muestra de vesícula extracelular, o EV, y el control.Coloque las muestras en un tubo de concentración de 15 mililitros o 500 microlitros, dependiendo del volumen inicial de la muestra EV. Centrifugar los tubos según las instrucciones del fabricante hasta obtener una muestra casi seca. Vuelva a suspender las muestras concentradas de EV con 200 microlitros, y el grupo de control con 100 microlitros de diluyente C, y transfiéralas a nuevos tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.Separe la muestra EV en dos alícuotas de 100 microlitros cada una. Marque una de las alícuotas con tinte y úsela como tratamiento. Deje el otro sin marcar, pero procese como la muestra EV y úselo para cuantificar la concentración de EV mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas.Prepare la solución de colorante 2x de tal manera que la concentración resultante de la solución de PKH26 en el diluyente C sea de ocho micromolares. Mezcle un microlitro de enlazador PKH26 milimolar por 125 microlitros de diluyente C en la muestra. Prepare el volumen necesario para agregar a las muestras en una proporción de 1:1.Agregue 2x solución de colorante a los EV derivados del lisado plaquetario PKH y muestres de control en una proporción de 1: 1, para lograr una concentración de colorante 1x y una concentración de PKH26 micromolar. Agregue el mismo volumen de PBS a la muestra ev derivada del lisado plaquetario NTA. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Agregue una solución de albúmina-PBS sérica bovina al 5% a las muestras en una proporción de 1: 1 y asegúrese de que el volumen final sea de aproximadamente 400 microlitros. Proceda a separar los EV etiquetados del tinte no unido y las interacciones de tinte no específico con la columna. Retire la tapa de la columna, agregue 400 microlitros de EV derivados del lisado plaquetario PKH, EV derivados del lisado plaquetario NTA o controle y deseche todo el líquido eluido.Espere a que la muestra entre completamente en la columna antes de continuar con el siguiente paso. Agregue 600 microlitros de PBS y deseche todo el líquido eluido. Espere a que el PBS ingrese la columna por completo antes de continuar con el siguiente paso.Agregue 600 microlitros de PBS y recoja una fracción de 600 microlitros en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Para una nueva columna, repita los pasos que implican la concentración de las muestras mencionadas al principio del protocolo. Agregue 600 microlitros de vehículos eléctricos previamente eluidos a la columna y deseche el volumen eluido.Luego agregue 400 microlitros de PBS y deseche todos los volúmenes eluidos. Agregue 600 microlitros de PBS a la columna y recoja una fracción de 600 microlitros en un tubo centrífugo de 1.5 mililitros. Lave el cartílago dos veces con PBS y apóselo con una punción de biopsia de tres milímetros de diámetro en condiciones estériles.Coloque los explantes en placas de cultivo de 96 pocillos con medio DMEM-F12, complementado con estreptomicina de penicilina al 1% a 37 grados centígrados, 5% de CO2 y 80% de humedad. Para establecer un modelo de OA impulsado por la inflamación, complemente el medio de cultivo celular con 10 nanogramos por mililitro de oncostatina M y dos nanogramos por mililitro de factor de necrosis tumoral alfa. Tratar los explantes con 1 veces 10 a la 9ª partícula por pocillo de EV derivados del lisado plaquetario PKH, o control, en medio de cultivo celular suplementado con oncostatina M y factor de necrosis tumoral alfa.Retire el medio de las placas de cultivo celular de 96 pocillos que contienen explantes de cartílago. Agregue 200 microlitros del medio de cultivo celular a cada pozo como se describe en el manuscrito. Detenga el ensayo in vitro cada hora de cero a cinco horas.Lave los pocillos de cultivo celular que contienen los explantes de cartílago dos veces con 200 microlitros de PBS. Agregue 100 microlitros de paraformaldehído al 4% al tejido para fijarlo durante tres horas a cuatro grados centígrados. Retire el PFA, agregue 100 microlitros de PBS, almacene el tejido fijo a cuatro grados Celsius y procese las muestras dentro de las 48 horas.Las imágenes tomadas en diferentes puntos de tiempo muestran cómo los EV ingresan al tejido hasta que alcanzan los condrocitos y entran en los condrocitos con el tiempo. Los EV marcados ya estaban localizados alrededor de los condrocitos después de una hora de incubación. Asegúrese de que el volumen inicial de evs sea suficiente para alcanzar la concentración final de partículas deseada.Otra cosa importante a recordar es usar los vehículos eléctricos etiquetados dentro de las próximas 24 horas. Si no lo usa dentro de las 24 horas, puede ocurrir una disminución en la fluorescencia. Esta técnica ayudará a los investigadores a mejorar las imágenes ev y a estudiar los EV en biología y terapéutica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

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