Name: labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Bu araştırma, ESF Avrupa Sosyal Fonu ve ERDF Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (MS16/00124) tarafından ortaklaşa finanse edilen Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad tarafından finanse edildi; CP16/00124); Balear Adaları'nın sürdürülebilir turizm vergisi tarafından finanse edilen PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18) tarafından; Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); FUTURMed bünyesindeki FOLIUM doktora sonrası programı (FOLIUM 17/01) tarafından, Balear Adaları'nın sürdürülebilir turizm vergisi ile% 50 ve ESF tarafından% 50 oranında finanse edilir; ve Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03) tarafından.

NOT: Projenin CEI-IB (IB 3656118 PI) tarafından etik olarak onaylanmasından sonra kurumsal yönergelere uygun olarak IdISBa Biobank'tan (IB 1995/12 BIO) kıkırdak eksplantları alınmıştır.
1. Sütun hazırlama
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek veya aşağıdaki gibi sütunları dengele:<ol>
<li>Sütun kapağını çıkarın ve sütunu dengeleyin. Depolama arabelleği elution ile çıkarın.</li>
		<li>Kolonu 2,5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkayın. Her yıka...

<ol>
	<li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+the+synovium,+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis.">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li><li>Zyli&#324;ska, B., Silmanowicz, P., Sobczy&#324;ska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+articular+cartilage+defects:+Focus+on+tissue+engineering.">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li><li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions.">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering.">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li><li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis.">et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression.">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury.">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li><li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair.">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis:+a+systematic+review.">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).</li><li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions.">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li><li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response.">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li><li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graefe's+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease.">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li><li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes.">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).</li><li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology:+an+in+vitro+study.">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).</li><li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy.">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).</li><li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA,+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment.">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li><li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes.">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).</li><li>de Miguel P&#233;rez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis,+intracellular+sorting,+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells.">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li><li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis.">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li><li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+extracellular+vesicles:+Current+and+emerging+methods.">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).</li><li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters.">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029 (2015).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection.">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li><li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo.">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li><li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model.">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).</li><li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury.">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li><li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury.">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li><li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021)</li><li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li><li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry.">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging.">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li></ol>

EV görüntüleme, serbest bırakma ve alma mekanizmaları gibi EV özelliklerinin anlaşılmasına yardımcı olur. Görüntülemeleri, biyodistribasyonlarının izlenmesini ve farmakokinetik özelliklerinin ilaç araçları olarak nitelendirilmesini sağlar. Bununla birlikte, EV görüntüleme ve izleme küçük boyutları nedeniyle zor olabilir, ancak araştırmacıların TÜP BEBEK ve in vivo koşullarda EV'leri izlemelerine yardımcı olmak için birçok görüntüleme cihazı ve etiketleme tekniğ...

Osteoartrit (OA), eklem kıkırdaklının hücre dışı matrisinin ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir iltihaplanma ve yok edilmesi anlamına gelen eklem dejeneratif bir hastalıktır1. Çeşitli artrit formları çok sayıda tedaviye sahip olmasına rağmen2,3,4, bunlar yan etkileri ve sınırlı etkinliği ile kısıtlanır. Erken OA kıkırdak lezyonlarında yaralı kıkırdağın rejeneratif tedavisi için otolog kondrosit implantasyonu kullanılarak doku mühendisliği teknikleri rutin olarak uygulanmaktadır4. Hücre bazlı tedaviler esas olarak kıkırdağı etkili bir şekilde onarabilen fenotipik olarak stabil kondrositlerin veya kondroprogogenitatörlerin sınırlı sayıda nedeniyle kısıtlanır3. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesini önlemek ve büyük kıkırdak lezyonlarını yenilemek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi son derece önemlidir.
Hücre dışı veziklinler (EV' ler) farklı yazarlar tarafından OA için bir tedavi olarak önerilmiştir5,6. EV'ler hücre tiplerinin çoğunluğu tarafından salgılanan membranöz cisimlerdir, hücreler arası sinyalizasyonda yer almaktadır ve kök hücrelerin terapötik etkilerini7,8,9, son zamanlarda rejeneratif tıbba ilgi uyandırdıkları gösterilmiştir10. Mezenkimal stromal hücrelerden (MSC) elde edilen EV'ler, OA için araştırılan ana terapötik EV'lerdir, ancak diğer eklemle ilişkili hücreler EV kaynakları olarak kullanılmıştır, örneğin, kondroprogenitörler veya bağışıklık hücreleri11,12.
Trombosit lizazları (PL' ler) gibi trombosit konsantreleri, kornea ülserleri13 , 14,15veya tendon dokusu rejenerasyon16 gibi farklı yaralanmalarda yara iyileşmesini arttırmak için kullanılır, çünkü trombosit konsantrelerinin EV bileşeninin bu etkilerden sorumlu olabileceği hipotezi nedeniyle17 . Eklemle ilgili hastalıklarla ilgili bazı çalışmalar osteoartrit koşullarını iyileştirmek için tedavi olarak trombosit türevli EV'ler (PL-EV' ler) kullanmaktadır. PL-EV'ler, osteoarthride kondrojenik belirteçlerin ekspresyonunu teşvik eden Wnt/β-catenin yolu18'ietkinleştirerek kondrosit çoğalmasını ve hücre göçünü iyileştirir veya PL-EV'lerle tedavi edilen osteoartritli tavşanlarda daha yüksek kondrojenik protein seviyeleri ve daha az tissular anormallik gösteren19.
EV'ler, hedef hücreye serbest bırakılan proteinler, lipitler ve nükleik asitler içerir ve terapötik uygulamalarıyla ilgili ana özellik olan hücreden hücreye iletişim kurar20. EV'lerin etkileri, hücrelere ulaşmalarına ve daha sonra kargo salınımlarına bağlıdır. Bu etki, metabolik aktivite veya gen ekspresyon modifikasyonu gibi hücrelerde neden olduğu değişikliklerle dolaylı olarak doğrulanabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, EV'lerin işlevlerini uygulamak için hücrelere nasıl ulaştığının görselleştirilmesine izin vermez. Bu nedenle, bu makale, iltihaplı OA kıkırdak eksplantları için bir tedavi olarak kullanılacak bu PL türevi EV'leri etiketlemek için bir yöntem sürmektedir. Konfokal mikroskopi, EV alımını ve eksplantlarda bulunan kondrositlere ilerlemeyi 5 saatlik bir zaman atlamalı olarak izlemek için kullanıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe BD Plastipak</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>1.310.901.211</td>
			<td>Prepared at 20% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol Pharmpur</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch with plunger 3 mm</td>
			<td>Scandidact</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum&#160;Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Prepared at 5% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartilage explants</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MCP100C41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrating tube 500 &#181;L Nanosep 100 kD Omega</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OD003C33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 24 x 60 mm</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded paraffin tissue blocks</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exo-spin mini-HD columns</td>
			<td>Cell guidance systems</td>
			<td>EX05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather S35 Microtome Blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>43037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 &#181;g/&#181;L diluten in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td>Prepared at 4% with PBS and stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100x</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI26</td>
			<td>PKH26 and Dliuent C included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>SO019911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td>Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 &#181;g/&#181;L diluted in PBS-0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>XI0050005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Finesse 325 Manual Microtome</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>A78100101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS-SPE confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>5200000271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of extracellular vesicles for monitoring migration and uptake in cartilage explants

Hücre dışı veziklinler (EV'ler), trombosit lisat (PL) gibi hücresel kaynaklarından elde edilen kargoları nedeniyle hücresiz bir tedavi olarak potansiyellerini kanıtlamak için farklı çalışmalarda kullanılır. Tedavi olarak kullanıldığında, EV'lerin hedef hücrelere girmesi ve bunlardan bir yanıt etkilemesi beklenir. Bu araştırmada PL türevli EV'ler osteoartrit (OA) için hücresiz bir tedavi olarak incelenmiştir. Böylece, EV'leri etiketlemek ve kıkırdak eksplantları üzerinde alımlarını test etmek için bir yöntem kuruldu. PL türevli EV'ler lipofilik boya PKH26 ile etiketlenir, bir sütundan iki kez yıkanır ve daha sonra nanopartikül izleme analizi (NTA) ile parçacık nicelesinden sonra 5 saat boyunca in vitro inflamasyon tahrikli bir OA modelinde test edilir. Saatlik olarak, kıkırdak eksplantları sabitlenir, parafinlenir, slaytlara monte etmek için 6 μm bölümlere kesilir ve konfokal mikroskop altında gözlemlenir. Bu, EV'lerin bu süre zarfında hedef hücrelere (kondrositler) girip girmediğinin doğrulanmasına ve doğrudan etkilerinin analiz edilip edilmediğinin doğrulanmasına olanak tanır.

Şekil 1'de EV etiketleme ve alım izleme için şematik bir genel bakış görüntülenir. Tablo 1'de NTA tarafından tespit edilen parçacık konsantrasyonu ve EV boyutu, sütunla etiketlendikten sonra iki kez gerçekleştirilen saflaştırma adımı nedeniyle ev konsantrasyonunun işlem sırasında azaldığını göstermektedir. Bununla birlikte, elde edilen miktar, tedavi için kullanılacak partikül sayısının en uygun aralığındadır. Bu parçacık konsantrasyonu...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants at JoVE.com

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Burada, osteoartrit için model olarak kullanılan kıkırdak eksplantlarında göçlerini ve alımlarını izlemek için trombositten türetilmiş hücre dışı veziklikleri etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Bu basit protokol, EV'leri etiketlemeye ve konfokal mikroskopi ile izlemeye izin verir. Örneğin, EV görüntüleme, terapötiklerde kullanılırken EV dağılımını değerlendirmede yardımcı olabilir. Bu teknik, herhangi bir özel işleve sahip olmadan konfokal mikroskopi ile EV göçünü ve kıkırdak eksplantlarında alımı kolayca izlemenizi sağlar.Aynı protokol TÜP BEBEK veya in vivo deneyler için DEE'ler için de kullanılabilir. Sütunların önceden hazırlandığından ve ÇEV'lerin başlangıç hacminin, arınma adımı sırasında parçacıkların yaklaşık% 10'unun kaybolacağını göz önünde bulundurarak istenen nihai parçacık konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun. Hücre dışı veziklikten veya EV'den, numuneden ve kontrolden konsantre olarak başlayın.Numuneleri, EV örneğinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mililitre veya 500 mikrolitre konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın. Konsantre EV örneklerini 200 mikrolitre ile ve kontrol grubunu 100 mikrolitre seyreltici C ile yeniden askıya alın ve yeni 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.EV örneğini her biri 100 mikrolitrelik iki aliquot'a ayırın. Aliquotlardan birini boya ile işaretleyin ve tedavi olarak kullanın. Diğerini işaretsiz bırakın, ancak EV örneği gibi işleyin ve nanopartikül izleme analizi ile EV konsantrasyonu ölçmek için kullanın.2x boya çözeltisi hazırlayın, böylece seyreltici C'de elde eden PKH26 çözeltisi konsantrasyonu sekiz mikromolardır. Numunede 125 mikrolitre seyreltici C başına bir milimoler PKH26 bağlayıcı mikrolitre karıştırın. Örneklere eklemek için gereken hacmi 1:1 oranında hazırlayın.1x boya konsantrasyonu ve dört mikromoler PKH26 konsantrasyonu elde etmek için PKH trombosit lysate türevi EV'lere 2x boya çözeltisi ekleyin ve numuneleri 1:1 oranında kontrol edin. NTA trombosit lisat türevi EV örneğine aynı pbs hacmini ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yaslanın.Örneklere 1:1 oranında %5 sığır serum albümin-PBS çözeltisi ekleyin ve son hacmin yaklaşık 400 mikrolitre olduğundan emin olun. Etiketli EV'leri sütunla ilişkisiz boya ve spesifik olmayan boya etkileşimlerinden ayırmaya devam edin. Kapağı sütundan çıkarın, 400 mikrolitre PKH trombosit lisat türevi EV, NTA trombosit lysate türevi EV'ler ekleyin veya elde edilen tüm sıvıları kontrol edin ve atın.Sonraki adıma geçmeden önce örneğin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 mikrolitre PBS ekleyin ve tüm eluted sıvıyı atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce PBS'nin sütunu tamamen girmesini bekleyin.600 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 600 mikrolitrenin bir kısmını toplayın. Yeni bir sütun için, protokolün başında belirtilen örneklerin konsantrasyonunu içeren adımları yineleyin. Sütuna daha önce elflenmiş 600 mikrolitre EV ekleyin ve eluted birimi atın.Ardından 400 mikrolitre PBS ekleyin ve tüm zorlanmış birimleri atın. Sütuna 600 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde 600 mikrolitrenin bir kısmını toplayın. Kıkırdağı PBS ile iki kez yıkayın ve steril koşullar altında üç milimetre çapında biyopsi zımbası kullanarak kesin.Eksplantları, 37 santigrat derecede%1 penisilin streptomisi, %5 CO2 ve %80 nem ile desteklenmiş DMEM-F12 orta boy 96 kuyu kültür plakalarına yerleştirin. İnflamasyon odaklı bir OA modeli oluşturmak için, hücre kültürü ortamını mililitre onkostatin M başına 10 nanogram ve tümör nekroz faktörü-alfa mililitresi başına iki nanogram ile destekleyin. Eksplantları PKH trombosit lizat türevli EV'lerin kuyusu başına 1 kez 10 ila 9. parçacıklarla tedavi edin veya onkostatin M ve tümör nekroz faktörü-alfa ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında kontrol edin.Ortamı kıkırdak eksplantları içeren 96 kuyu hücre kültürü plakalarından çıkarın. Her birine, el yazmasında açıklandığı gibi 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Tüp bebek testini her saat sıfırdan beş saate kadar durdurun.Kıkırdak eksplantlarını içeren hücre kültürü kuyularını 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Dört santigrat derecede üç saat boyunca düzeltmek için dokuya% 4 paraformaldehit 100 mikrolitre ekleyin. PFA'yı çıkarın, 100 mikrolitre PBS ekleyin, sabit dokuyu dört santigrat derecede saklayın ve örnekleri 48 saat içinde işleyin.Farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler, EV'lerin kondrositlere ulaşana kadar dokuya nasıl girdiğini ve zamanla kondrositlere nasıl girdiğini gösterir. Etiketli EV'ler, bir saatlik inkübasyondan sonra kondrositlerin etrafında zaten yerelleştirilmişti. EV'lerin ilk hacminin istenen son parçacık konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli olduğundan emin olun.Unutulmaması gereken bir diğer önemli şey de etiketli EV'leri önümüzdeki 24 saat içinde kullanmaktır. 24 saat içinde kullanılmazsa floresanlarda azalma meydana gelebilir. Bu teknik, araştırmacıların EV görüntülemesini geliştirmelerine ve biyoloji ve terapötiklerdeki EV'leri incelemelerine yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Gerçek zamanlı görselleştirme ve analiz nedeniyle tam olarak olduğu gibi fare kıkırdak Explants mekanik yükleme kondrosit yaralanma

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...