Name: platelet-derived extracellular vesicle functionalization of ti implants
Uploaded: 2021-08-05T14:45:00
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Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), et PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financés par la taxe de tourisme durable des îles Baléares.

Le lysat plaquettaire (PL) est obtenu comme décrit précédemment conformément aux directives institutionnelles3 en utilisant des manteaux bouffants frais fournis par la biobanque IdISBa comme matériau de départ. Leur utilisation pour le projet actuel a été approuvée par son comité d’éthique (IB 1995/12 BIO).
1. Isolation des véhicules électriques du PL
<ol><li>Enlèvement des corps plus grands<ol>
<li>Décongeler le PL à température ambiante.</li>
		<l...

<ol>
	<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Torreggiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+novel+effectors+of+human+platelet+lysate+activity.">Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity.</a> European Cells &amp; Materials. 28, 137-151 (2014).</li><li>Antich-Rossell&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+extracellular+vesicles+promote+osteoinduction+of+mesenchymal+stromal+cells.">Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells.</a> Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+of+Ti-based+alloys+for+biomedical+applications.">New developments of Ti-based alloys for biomedical applications.</a> Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).</li><li>Lan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+a+nanostructured+titanium+oxide+layer+with+self-assembled+monolayers+for+biomedical+applications:+Surface+properties+and+biomechanical+behaviors.">The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors.</a> Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).</li><li>Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+and+their+effects+on+titanium+dental+implants.">Surface modifications and their effects on titanium dental implants.</a> BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).</li><li>Damiati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+surface+topography+and+coating+on+osteogenesis+and+bacterial+attachment+on+titanium+implants.">Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants.</a> Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+human+adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicle-functionalized+biotin-doped+polypyrrole+titanium+with+long-term+stability+and+potential+osteoinductive+ability.">Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).</li><li>Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-integrated+titanium+oxide+nanotubes+for+targeted+bone+regeneration.">Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+influence+the+behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+titanium+surfaces.">Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces.</a> Biomaterials. 230, 119571 (2020).</li><li>Lozano-Ramos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography-based+enrichment+of+extracellular+vesicles+from+urine+samples.">Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+adult+schistosoma+japonicum.">Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudr&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+titanium+surface+modification+techniques+and+coatings+for+antibacterial+applications.">Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications.</a> Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).</li><li>C&#243;rdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., Gonz&#225;lez-Mart&#237;n, M. L., Ramis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+quercitrin+nanocoatings:+A+fluorescence-based+method+for+their+surface+quantification,+and+their+effect+on+stem+cell+adhesion+and+differentiation+to+the+osteoblastic+lineage.">Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).</li></ol>

Ce protocole vise à fournir des instructions claires pour la fonctionnalisation des véhicules électriques sur les surfaces Ti. La méthode présentée est basée sur une stratégie de coulée de goutte, qui est un type de fonctionnalisation de type physisorption. Il existe une mauvaise bibliographie concernant la fonctionnalisation des VE sur les surfaces Ti, bien qu’il existe peu d’études montrant des avantages différents en immobilisant les VE sur Ti10. Quoi qu’il en soit, certaines d...

Les VE sont des vésicules membranaires (30-200 nm) sécrétées par n’importe quelle cellule et jouent un rôle clé dans la communication de cellule à cellule en livrant leur cargaison. Ils contiennent une variété de biomolécules actives qui peuvent inclure des acides nucléiques, des facteurs de croissance ou des lipides bioactifs1. Pour ces raisons, les VE ont été évalués pour leur utilisation potentielle dans les thérapies. En termes d’orthopédie et de régénération osseuse, des véhicules électriques de différentes sources ont été testés. Parmi eux, il a été démontré que les VE dérivés de plaquettes induisent un effet de différenciation sur les cellules souches tout en maintenant un faible profil cytotoxique2,3. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires pour explorer la possibilité de combiner les VE avec des biomatériaux afin de les utiliser dans la pratique clinique quotidienne.
Les biomatériaux à base de titane sont largement utilisés comme échafaudages pour les interventions cliniques de guérison osseuse en raison de leurs propriétés mécaniques, de leur biocompatibilité élevée et de leur durabilité à long terme4. Néanmoins, les implants Ti sont un matériau bioinerte et, par conséquent, présentent une faible capacité de liaison avec le tissu osseux environnant5. Pour cette raison, des modifications du titane sont à l’étude afin d’améliorer leurs performances en réalisant un microenvironnement plus fonctionnel à sa surface4,6,7. En ce sens, les véhicules électriques peuvent être ancrés au titane par des interactions chimiques8 ou physiques9,10. Les VE immobilisés dérivés de cellules souches ou de macrophages améliorent la bioactivité du Ti en favorisant l’adhésion et la prolifération cellulaires, induisant ainsi un effet ostéogénique8,9,10.
Cet article se concentrera sur une stratégie de coulée goutte à goutte pour le revêtement des surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL en détail. De plus, nous évaluerons le profil de libération des VE de la surface revêtue au fil du temps et confirmerons sa biocompatibilité cellulaire in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,8 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16592K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolut ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 20 %&#160; ethanol with Milli-Q&#174; water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA purifier System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coutler</td>
			<td>392934</td>
			<td>SX4750A swinging rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, Conical Bottom, 50ml</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BDH307736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Low Glucose Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep&#160;16/60 Sephacryl&#160;S-400 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9356-04</td>
			<td>Precast columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>946077135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 69,5%</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>AC16071000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td>SW-32Ti Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Test strips 4.5-10.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Lysate (PL)</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from&#160; buffy coats discarded after blood donation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubs</td>
			<td>Beckman Coutler</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power wave HT</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>10340763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 ml, (Lx&#216;): 120 x 17 mm, PP, with print</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hidroxide</td>
			<td>Sharlau</td>
			<td>SO04251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium implants replicas</td>
			<td>Implantmedia, SA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1 X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-derived extracellular vesicle functionalization of ti implants

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanovésicules biologiques qui jouent un rôle clé dans la communication cellulaire. Leur contenu comprend des biomolécules actives telles que des protéines et des acides nucléiques, qui présentent un grand potentiel en médecine régénérative. Plus récemment, les VÉHICULES dérivés du lysat plaquettaire (PL) ont montré une capacité ostéogénique comparable à la PL. En outre, les biomatériaux sont fréquemment utilisés en orthopédie ou en restauration dentaire. Ici, nous fournissons une méthode pour fonctionnaliser les surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL afin d’améliorer leurs propriétés ostéogéniques.
Les VE sont isolés du PL par chromatographie d’exclusion de taille, puis les surfaces Ti sont fonctionnalisées avec des PL-EV par coulée goutte. La fonctionnalisation est prouvée par la libération des VE et sa biocompatibilité par le test de libération de lactate déshydrogénase (LDH).

La méthode présentée dans cet article permet d’obtenir des disques de titane fonctionnalisés par VE. Les véhicules électriques sont physiquement liés à la surface, ce qui permet une libération prolongée au fil du temps. La quantité de VE libérés peut être mesurée par NTA les jours 2, 6, 10 et 14. Les premières mesures, le jour 2, montrent qu’environ 109 véhicules électriques sont libérés, suivis d’une libération prolongée le jour 6 (~ 108 véhicules électriques); jour 10...

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Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Nous présentons ici une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires (VE) dérivées des lysats plaquettaires (PL) et leur utilisation pour le revêtement des surfaces implantaires en titane (Ti). Nous décrivons la méthode de revêtement par coulée goutte, le profil de libération des VE des surfaces et la biocompatibilité in vitro des surfaces Ti revêtues de VE.

Fonctionnalisation des vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes des implants Ti

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...

La combinaison de vésicules extracellulaires avec des biomatériaux est une approche souhaitable pour les études de médecine régénérative. Ainsi, cette étude rapporte la fonctionnalisation du titane avec les VE comme un outil pratique pour l’orthopédie et la régénération osseuse. La fonctionnalisation par coulée goutte est une méthode facile et peu coûteuse par rapport à d’autres stratégies telles que le piégeage polymère ou la liaison biochimique.Commencez la fonctionnalisation de la surface en titane en lavant les disques de titane avec de l’eau désionisée dans un bécher en verre. Ensuite, jetez l’eau avant de laver les disques avec de l’éthanol à 70%. Décantez la solution pour soniquer les implants lavés à 50 ° C pendant cinq minutes dans de l’eau désionisée.Après avoir jeté l’eau, incubez les implants en titane dans une solution d’hydroxyde de sodium à 40% à 50 ° C pendant 10 minutes avec agitation, puis soniquez les implants dans de l’eau désionisée comme démontré. Ensuite, effectuez au moins cinq lavages des implants avec de l’eau désionisée. Jusqu’à ce que le pH soit neutre sur l’indicateur de pH.Répétez le processus de sonication et d’incubation, comme expliqué précédemment, en remplaçant l’hydroxyde de sodium par de l’acide nitrique à 50%. Effectuez les lavages et la sonication avec de l’eau désionisée avant de stocker les implants dans une solution à 70% d’éthanol. Incuber les implants en titane dans une solution d’acide nitrique à 30% pendant 30 minutes à température ambiante avec une légère agitation.Après l’incubation, effectuez au moins cinq lavages à l’eau désionisée jusqu’à ce que le pH soit neutre sur les indicateurs de pH. Ensuite, incubez des implants en titane pendant la nuit à température ambiante dans de l’eau désionisée. Le lendemain, séchez les implants sous vide à 40 °C pendant 10 minutes.En travaillant sous l’armoire de culture cellulaire, placez les implants en titane dans une plaque de 96 puits avec le côté machine tourné vers le haut. Organisez la coulée des vésicules extracellulaires par décongélation de la solution des VE et la solution vortexing à une impulsion de trois secondes. Après mélange, déposez 40 microlitres de la solution de VE sur la surface du titane pour immobiliser un maximum de 4 x 10^11 VE par implant, selon la concentration déterminée par analyse de suivi des nanoparticules.Ensuite, placez les plaques sous vide à 37 ° C pendant environ deux heures ou jusqu’à ce que les gouttes soient complètement sèches. Ajustez le temps de séchage en fonction du nombre d’implants en titane et de l’eau présente dans la chambre à vide. La quantité de véhicules électriques libérés par les disques de titane a été mesurée par analyse de suivi des nanoparticules.Le jour 2, environ 10 ^ 9 véhicules électriques ont été libérés, suivis d’une libération prolongée les jours 6, 10 et 14. La biocompatibilité cellulaire in vitro des VE en titane a été évaluée à l’aide d’un test de libération de lactate déshydrogénase, ou LDH, 48 heures après l’ensemencement des cellules sur les implants. Les VE en titane présentaient une quantité de LDH inférieure à la valeur cytotoxique maximale acceptée.Alors que le groupe témoin du titane présentait des niveaux d’activité LDH plus élevés. L’étape la plus importante est le séchage sous vide de l’implant revêtu. Il est important de s’assurer que toute l’eau est évaporée pour obtenir une physisorption optimale.

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