Name: platelet-derived extracellular vesicle functionalization of ti implants
Uploaded: 2021-08-05T14:45:00
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Questa ricerca è stata finanziata dall'Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanziato dal Fondo sociale europeo del FSE e dal Fondo europeo di sviluppo regionale del FESR (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), e PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziato dalla tassa sul turismo sostenibile delle Isole Baleari.

Il Lisato Piastrinico (PL) è ottenuto come precedentemente descritto in conformità alle linee guida istituzionali3 utilizzando come materiale di partenza i freschi buffy coat forniti dalla Biobanca IdISBa. Il loro utilizzo per il progetto in corso è stato approvato dal suo Comitato Etico (IB 1995/12 BIO).
1. Isolamento dei veicoli elettrici da PL
<ol><li>Rimozione di corpi più grandi<ol>
<li>Scongelare PL a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifuga PL a 1.500 x ...

<ol>
	<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Torreggiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+novel+effectors+of+human+platelet+lysate+activity.">Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity.</a> European Cells &amp; Materials. 28, 137-151 (2014).</li><li>Antich-Rossell&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+extracellular+vesicles+promote+osteoinduction+of+mesenchymal+stromal+cells.">Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells.</a> Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+of+Ti-based+alloys+for+biomedical+applications.">New developments of Ti-based alloys for biomedical applications.</a> Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).</li><li>Lan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+a+nanostructured+titanium+oxide+layer+with+self-assembled+monolayers+for+biomedical+applications:+Surface+properties+and+biomechanical+behaviors.">The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors.</a> Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).</li><li>Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+and+their+effects+on+titanium+dental+implants.">Surface modifications and their effects on titanium dental implants.</a> BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).</li><li>Damiati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+surface+topography+and+coating+on+osteogenesis+and+bacterial+attachment+on+titanium+implants.">Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants.</a> Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+human+adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicle-functionalized+biotin-doped+polypyrrole+titanium+with+long-term+stability+and+potential+osteoinductive+ability.">Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).</li><li>Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-integrated+titanium+oxide+nanotubes+for+targeted+bone+regeneration.">Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+influence+the+behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+titanium+surfaces.">Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces.</a> Biomaterials. 230, 119571 (2020).</li><li>Lozano-Ramos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography-based+enrichment+of+extracellular+vesicles+from+urine+samples.">Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+adult+schistosoma+japonicum.">Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudr&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+titanium+surface+modification+techniques+and+coatings+for+antibacterial+applications.">Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications.</a> Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).</li><li>C&#243;rdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., Gonz&#225;lez-Mart&#237;n, M. L., Ramis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+quercitrin+nanocoatings:+A+fluorescence-based+method+for+their+surface+quantification,+and+their+effect+on+stem+cell+adhesion+and+differentiation+to+the+osteoblastic+lineage.">Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).</li></ol>

Questo protocollo mira a fornire istruzioni chiare per la funzionalizzazione dei veicoli elettrici sulle superfici Ti. Il metodo presentato si basa su una strategia di drop casting, che è un tipo di funzionalizzazione di fisisorbimento. Esiste una scarsa bibliografia per quanto riguarda la funzionalizzazione dei veicoli elettrici sulle superfici Ti, anche se ci sono pochi studi che mostrano diversi vantaggi immobilizzando i veicoli elettrici su Ti10. Ad ogni modo, alcune delle strategie esplorate...

I veicoli elettrici sono vescicole di membrana (30-200 nm) secrete da qualsiasi cellula e svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula-cellula consegnando il loro carico. Contengono una varietà di biomolecole attive che possono includere acidi nucleici, fattori di crescita o lipidi bioattivi1. Per questi motivi, i veicoli elettrici sono stati valutati per il loro potenziale utilizzo in terapia. In termini di ortopedia e rigenerazione ossea, sono stati testati veicoli elettrici provenienti da diverse fonti. Tra questi, è stato dimostrato che i veicoli elettrici derivati dalle piastrine inducono un effetto di differenziazione sulle cellule staminali mantenendo un basso profilo citotossico2,3. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare la possibilità di combinare i veicoli elettrici con i biomateriali al fine di utilizzarli nella pratica clinica quotidiana.
I biomateriali a base di titanio sono ampiamente utilizzati come scaffold per interventi clinici di guarigione ossea grazie alle loro proprietà meccaniche, all'elevata biocompatibilità e alla durata a lungo termine4. Tuttavia, gli impianti Ti sono un materiale bioinerte e, pertanto, presentano una scarsa capacità di legame con il tessuto osseo circostante5. Per questo motivo, le modifiche del titanio sono in fase di studio al fine di migliorare le loro prestazioni ottenendo un microambiente più funzionale sulla sua superficie4,6,7. In questo senso, i veicoli elettrici possono essere ancorati al titanio da interazioni chimiche8 o fisiche9,10. Gli EV immobilizzati derivati da cellule staminali o macrofagi migliorano la bioattività di Ti promuovendo l'adesione e la proliferazione cellulare inducendo così un effetto osteogenico8,9,10.
Questo articolo si concentrerà su una strategia di drop casting per il rivestimento di superfici Ti con veicoli elettrici derivati da PL in dettaglio. Inoltre, valuteremo il profilo di rilascio dei veicoli elettrici dalla superficie rivestita nel tempo e confermeremo la sua biocompatibilità cellulare in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,8 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16592K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolut ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 20 %&#160; ethanol with Milli-Q&#174; water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA purifier System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coutler</td>
			<td>392934</td>
			<td>SX4750A swinging rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, Conical Bottom, 50ml</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BDH307736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Low Glucose Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep&#160;16/60 Sephacryl&#160;S-400 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9356-04</td>
			<td>Precast columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>946077135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 69,5%</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>AC16071000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td>SW-32Ti Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Test strips 4.5-10.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Lysate (PL)</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from&#160; buffy coats discarded after blood donation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubs</td>
			<td>Beckman Coutler</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power wave HT</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>10340763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 ml, (Lx&#216;): 120 x 17 mm, PP, with print</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hidroxide</td>
			<td>Sharlau</td>
			<td>SO04251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium implants replicas</td>
			<td>Implantmedia, SA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1 X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-derived extracellular vesicle functionalization of ti implants

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanovescicole biologiche che svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellulare. Il loro contenuto include biomolecole attive come proteine e acidi nucleici, che presentano un grande potenziale nella medicina rigenerativa. Più recentemente, i veicoli elettrici derivati dal lisato piastrinico (PL) hanno mostrato una capacità osteogenica paragonabile alla PL. Inoltre, i biomateriali sono spesso utilizzati in ortopedia o restauro dentale. Qui, forniamo un metodo per funzionalizzare le superfici Ti con EV derivati da PL al fine di migliorare le loro proprietà osteogeniche.
I veicoli elettrici sono isolati dal PL mediante cromatografia di esclusione dimensionale e successivamente le superfici Ti vengono funzionalizzate con PL-EV mediante drop casting. La funzionalizzazione è dimostrata dal rilascio di veicoli elettrici e dalla sua biocompatibilità mediante il test di rilascio della lattato deidrogenasi (LDH).

Il metodo presentato in questo articolo consente di ottenere dischi in titanio funzionalizzati EV. I veicoli elettrici sono fisicamente legati alla superficie, il che consente un rilascio prolungato nel tempo. La quantità di veicoli elettrici rilasciati può essere misurata da NTA nei giorni 2, 6, 10 e 14. Le prime misurazioni, il giorno 2, mostrano che vengono rilasciati circa 109 veicoli elettrici, seguiti da un rilascio prolungato il giorno 6 (~ 108 veicoli elettrici); giorno 10 (~ 107</sup...

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Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Qui presentiamo un metodo per l'isolamento delle vescicole extracellulari (EV) derivate dai lisati piastrinici (PL) e il loro uso per il rivestimento delle superfici implantari in titanio (Ti). Descriviamo il metodo di rivestimento drop casting, il profilo di rilascio EV dalle superfici e la biocompatibilità in vitro delle superfici Ti rivestite con EV.

Funzionalizzazione delle vescicole extracellulari di derivazione piastrinica degli impianti Ti

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...

La combinazione di vescicole extracellulari con biomateriali è un approccio desiderabile per gli studi di medicina rigenerativa. Pertanto, questo studio riporta la funzionalizzazione del titanio con i veicoli elettrici come strumento pratico per l'ortopedia e la rigenerazione ossea. La funzionalizzazione del drop casting è un metodo facile e a basso costo rispetto ad altre strategie come l'intrappolamento polimerico o il legame biochimico.Inizia la funzionalizzazione della superficie in titanio lavando i dischi di titanio con acqua deionizzata in un becher di vetro. Quindi scartare l'acqua prima di lavare i dischi con il 70% di etanolo. Decantare la soluzione per sonicare gli impianti lavati a 50 C per cinque minuti in acqua deionizzata.Dopo aver scartato l'acqua incubare gli impianti in titanio in una soluzione di idrossido di sodio al 40% a 50 C per 10 minuti con agitazione e quindi sonicare gli impianti in acqua deionizzata come dimostrato. Successivamente, eseguire almeno cinque lavaggi degli impianti con acqua deionizzata. Fino a quando il pH non è neutro sull'indicatore di pH.Ripetere il processo di sonicazione e incubazione, come spiegato in precedenza, sostituendo l'idrossido di sodio con il 50% di acido nitrico. Eseguire i lavaggi e la sonicazione con acqua deionizzata prima di conservare gli impianti in una soluzione di etanolo al 70%. Incubare gli impianti in titanio in una soluzione di acido nitrico al 30% per 30 minuti a temperatura ambiente con una delicata agitazione.Dopo l'incubazione eseguire almeno cinque lavaggi con acqua deionizzata fino a quando il pH è neutro sugli indicatori di pH. Quindi incubare impianti in titanio durante la notte a temperatura ambiente in acqua deionizzata. Il giorno successivo, asciugare gli impianti sotto vuoto a 40 C per 10 minuti.Lavorando sotto l'armadio di coltura cellulare, posizionare gli impianti in titanio in una piastra a 96 pozzetti con il lato della macchina rivolto verso l'alto. Disporre per le vescicole extracellulari ev goccia colata scongelando la soluzione EV e vorticoso soluzione ad un impulso di tre secondi. Dopo la miscelazione, depositare 40 microlitri della soluzione EV sulla superficie del titanio per immobilizzare un massimo di 4 x 10 ^ 11 EV per impianto, in base alla concentrazione determinata dall'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.Quindi, posizionare le piastre in condizioni di vuoto a 37 C per circa due ore o fino a quando le gocce sono completamente asciutte. Regolare il tempo di asciugatura in base al numero di impianti in titanio e all'acqua presente nella camera a vuoto. La quantità di veicoli elettrici rilasciati dai dischi di titanio è stata misurata mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle.Il giorno 2, sono stati rilasciati circa 10 ^ 9 veicoli elettrici, seguiti da un rilascio prolungato nei giorni 6, 10 e 14. La biocompatibilità cellulare in vitro dei veicoli elettrici in titanio è stata valutata con la lattato deidrogenasi, o test di rilascio di LDH, a 48 ore dopo la semina cellulare sugli impianti. I veicoli elettrici in titanio hanno mostrato una quantità inferiore di LDH rispetto al valore citotossico massimo accettato.Considerando che, il gruppo di controllo in titanio, ha mostrato livelli di attività LDH più elevati. Il passo più importante è l'essiccazione sottovuoto dell'impianto rivestito. È importante assicurarsi che tutta l'acqua sia evaporata per ottenere un fisisorbimento ottimale.

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