Name: platelet-derived extracellular vesicle functionalization of ti implants
Uploaded: 2021-08-05T14:45:00
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Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), o Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) e PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares.

A plaqueta Lysate (PL) é obtida como descrito anteriormente em conformidade com as diretrizes institucionais3 utilizando casacos de buffy fresco fornecidos pelo IdISBa Biobank como material inicial. Sua utilização para o projeto atual foi aprovada pelo Comitê de Ética (IB 1995/12 BIO).
1. Isolamento de EVs do PL
<ol><li>Remoção de corpos maiores<ol>
<li>Descongelar PL em temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar PL a 1.500 x g para 15 min a 4 °C. ...

<ol>
	<li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Torreggiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+novel+effectors+of+human+platelet+lysate+activity.">Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity.</a> European Cells &amp; Materials. 28, 137-151 (2014).</li><li>Antich-Rossell&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+extracellular+vesicles+promote+osteoinduction+of+mesenchymal+stromal+cells.">Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells.</a> Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+of+Ti-based+alloys+for+biomedical+applications.">New developments of Ti-based alloys for biomedical applications.</a> Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).</li><li>Lan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+a+nanostructured+titanium+oxide+layer+with+self-assembled+monolayers+for+biomedical+applications:+Surface+properties+and+biomechanical+behaviors.">The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors.</a> Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).</li><li>Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+and+their+effects+on+titanium+dental+implants.">Surface modifications and their effects on titanium dental implants.</a> BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).</li><li>Damiati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+surface+topography+and+coating+on+osteogenesis+and+bacterial+attachment+on+titanium+implants.">Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants.</a> Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+human+adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicle-functionalized+biotin-doped+polypyrrole+titanium+with+long-term+stability+and+potential+osteoinductive+ability.">Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).</li><li>Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-integrated+titanium+oxide+nanotubes+for+targeted+bone+regeneration.">Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+influence+the+behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+titanium+surfaces.">Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces.</a> Biomaterials. 230, 119571 (2020).</li><li>Lozano-Ramos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography-based+enrichment+of+extracellular+vesicles+from+urine+samples.">Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+adult+schistosoma+japonicum.">Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudr&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+titanium+surface+modification+techniques+and+coatings+for+antibacterial+applications.">Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications.</a> Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).</li><li>C&#243;rdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., Gonz&#225;lez-Mart&#237;n, M. L., Ramis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+quercitrin+nanocoatings:+A+fluorescence-based+method+for+their+surface+quantification,+and+their+effect+on+stem+cell+adhesion+and+differentiation+to+the+osteoblastic+lineage.">Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).</li></ol>

Este protocolo visa fornecer instruções claras para a funcionalização dos EVs nas superfícies ti. O método apresentado baseia-se em uma estratégia de fundição de gota, que é um tipo de funcionalização de fissionação. A má bibliografia existe em relação à funcionalização de EVs nas superfícies de Ti, embora existam poucos estudos mostrando diferentes vantagens ao imobilizar EVs no Ti10. De qualquer forma, algumas das estratégias exploradas incluem ligação bioquímica8, armad...

Os EVs são vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por qualquer célula e desempenham um papel fundamental na comunicação célula-celular, entregando sua carga. Eles contêm uma variedade de biomoléculas ativas que podem incluir ácidos nucleicos, fatores de crescimento ou lipídios bioativos1. Por essas razões, os EVs têm sido avaliados por seu potencial uso na terapêutica. Em termos de ortopedia e regeneração óssea, EVs de diferentes fontes foram testados. Entre eles, os EVs derivados de plaquetas têm sido mostrados para induzir um efeito de diferenciação sobre as células-tronco, mantendo um perfil citotóxico baixo2,3. Portanto, mais pesquisas são necessárias para explorar a possibilidade de combinar EVs com biomateriais para usá-los na prática clínica diária.
Os biomateriais à base de titânio são amplamente utilizados como andaimes para intervenções clínicas de cicatrização óssea devido às suas propriedades mecânicas, alta biocompatibilidade e durabilidade a longo prazo4. No entanto, os implantes ti são um material biointendo e, portanto, apresentam uma baixa capacidade de ligação com o tecido ósseo circundante5. Por essa razão, modificações de titânio estão sendo estudadas para melhorar seu desempenho, alcançando um microambiente mais funcional em sua superfície4,6,7. Nesse sentido, os EVs podem ser ancorados em titânio por interações químicas8 ou físicas9,10. EVs imobilizados derivados de células-tronco ou macrófagos aumentam a bioatividade de Ti, promovendo a adesão celular e a proliferação, induzindo assim um efeito osteogênico8,9,10.
Este artigo se concentrará em uma estratégia de lançamento de gota para revestimento de superfícies Ti com EVs derivados de PL em detalhes. Além disso, avaliaremos o perfil de liberação de EVs da superfície revestida ao longo do tempo e confirmaremos sua biocompatibilidade celular in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0,8 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16592K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge tube</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC60015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>303174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC30096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolut ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET0006005P</td>
			<td>Used to prepare 20 %&#160; ethanol with Milli-Q&#174; water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA purifier System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>8149-30-0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coutler</td>
			<td>392934</td>
			<td>SX4750A swinging rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000210</td>
			<td>F-45-48-11 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, Conical Bottom, 50ml</td>
			<td>SPL life sciences</td>
			<td>PLC50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringes 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>BDH307736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Low Glucose Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21885025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>PBS-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep&#160;16/60 Sephacryl&#160;S-400 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9356-04</td>
			<td>Precast columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NS300</td>
			<td>Device with embedded laser at &#955;= 532 nm and camera sCMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>946077135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid 69,5%</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>AC16071000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8043-30-1124</td>
			<td>SW-32Ti Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution 100X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Test strips 4.5-10.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Lysate (PL)</td>
			<td>IdISBa Biobank</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from&#160; buffy coats discarded after blood donation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubs</td>
			<td>Beckman Coutler</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power wave HT</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>10340763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 ml, (Lx&#216;): 120 x 17 mm, PP, with print</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hidroxide</td>
			<td>Sharlau</td>
			<td>SO04251000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium implants replicas</td>
			<td>Implantmedia, SA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1 X</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platelet-derived extracellular vesicle functionalization of ti implants

Vesículos extracelulares (EVs) são nanovesculas biológicas que desempenham um papel fundamental na comunicação celular. Seu conteúdo inclui biomoléculas ativas, como proteínas e ácidos nucleicos, que apresentam grande potencial na medicina regenerativa. Mais recentemente, os EVs derivados de Plaqueta Lysate (PL) mostraram uma capacidade osteogênica comparável ao PL. Além disso, os biomateriais são frequentemente utilizados em ortopedia ou restauração dentária. Aqui, fornecemos um método para funcionalizar superfícies ti com EVs derivados de PL, a fim de melhorar suas propriedades osteogênicas.
Os EVs são isolados do PL por cromatografia de exclusão de tamanho, e depois as superfícies ti são funcionalizadas com PL-EVs por fundição de gota. A funcionalidade é comprovada pela liberação de EVs e sua biocompatibilidade pelo ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH).

O método apresentado neste artigo permite a obtenção de discos de titânio funcionalizados EVs. Os EVs são fisicamente ligados à superfície, o que permite uma liberação sustentada ao longo do tempo. A quantidade de EVs liberados pode ser medida pela NTA nos dias 2, 6, 10 e 14. As primeiras medições, no dia 2, mostram que cerca de 109 EVs são lançados, seguidos de uma liberação sustentada no dia 6 (~108 EVs); dia 10 (~107 EVs) e dia 14 (~107 EVs). Isso confirma uma...

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Platelet-Derived Extracellular Vesicle Functionalization of Ti Implants

Aqui, apresentamos um método para o isolamento de Vesículas Extracelulares (EVs) derivados das plaquetas (PL) e seu uso para revestimento de superfícies de implante de titânio (Ti). Descrevemos o método de revestimento de fundição de gota, o perfil de liberação de EVs das superfícies e a biocompatibilidade in vitro de superfícies Ti revestidas de EVs.

Funcionalização vesícula extracelular derivada de plaquetas de implantes ti

Extracellular Vesicles (EVs) are biological nanovesicles that play a key role in cell communication. Their content includes active biomolecules such as ...

A combinação de vesículas extracelulares com biomateriais é uma abordagem desejável para estudos de medicina regenerativa. Assim, este estudo relata a funcionalização de titânio com EVs como ferramenta prática para ortopedia e regeneração óssea. A funcionalização do fundição de gota é um método fácil e de baixo custo comparado com outras estratégias, como armadilha polimérica ou ligação bioquímica.Inicie a funcionalidade da superfície de titânio lavando os discos de titânio com água deionizada em um copo de vidro. Em seguida, descarte a água antes de lavar os discos com 70% de etanol. Decante a solução para sonicar os implantes lavados a 50 C por cinco minutos em água deionizada.Depois de descartar a água incubar implantes de titânio em uma solução de hidróxido de sódio de 40% a 50 C por 10 minutos com agitação e, em seguida, sonicar os implantes em água desionizada como demonstrado. Em seguida, realize pelo menos cinco lavagens dos implantes com água desionizada. Até que o pH seja neutro no indicador pH.Repita o processo de sônica e incubação, como explicado anteriormente, substituindo o hidróxido de sódio por ácido 50%. Realizar as lavagens e sônica com água deionizada antes de armazenar os implantes em uma solução de 70% de etanol. Incubar os implantes de titânio em uma solução de ácido nítrico de 30% por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.Após a incubação realizar pelo menos cinco lavagens com água desionizada até que o pH seja neutro em indicadores de pH. Em seguida, incubar implantes de titânio durante a noite em temperatura ambiente em água deionizada. No dia seguinte, seque os implantes sob vácuo a 40 C por 10 minutos.Trabalhando sob o armário de cultura celular, coloque implantes de titânio em uma placa de 96 poços com o lado da máquina voltado para cima. Organize para os EVs de vesículas extracelulares soltarem a fundição descongelando a solução de EVs e a solução de vórtice a um pulso de três segundos. Após a mistura, deposite 40 microliters da solução EVs na superfície de titânio para imobilizar um máximo de 4 x 10^11 EVs por implante, de acordo com a concentração determinada pela análise de rastreamento de nanopartículas.Em seguida, coloque as placas em condições de vácuo a 37 C por aproximadamente duas horas ou até que as gotas estejam completamente secas. Ajuste o tempo de secagem dependendo do número de implantes de titânio e da água presente na câmara de vácuo. A quantidade de EVs liberados de discos de titânio foi medida pela análise de rastreamento de nanopartículas.No dia 2, cerca de 10^9 EVs foram lançados, seguidos de um lançamento sustentado nos dias 6, 10 e 14. A biocompatibilidade in vitro celular dos EVs de titânio foi avaliada com lactato desidrogenase, ou ensaio de liberação de LDH, a 48 horas após a semeadura celular nos implantes. Os EVs de titânio apresentaram uma quantidade menor de LDH do que o valor citotóxico máximo aceito.Considerando que o grupo de controle de titânio apresentou níveis mais elevados de atividade LDH. O passo mais importante é a secagem a vácuo do implante revestido. É importante ter certeza de que toda a água é evaporada para obter a fissuração ideal.

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