Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB، GG، SB، KC أشكر بإخلاص لجنة المنح الجامعية (UGC)، UGC-BSR، DBT-INSPIRE، ومجلس البحوث العلمية والصناعية (CSIR) لزمالاتهم البحثية. ولحسن الحظ، نعترف بإدارة التكنولوجيا الأحيائية، وحكومة الهند، وإدارة العلوم والتكنولوجيا، وحكومة الهند، للحصول على الدعم المالي.

1. استنساخ الجينات في ناقلات الدخول والوجهة (الشكل 2)
<ol><li>تضخيم تسلسل الترميز (CDS) لجينات الفائدة (جينات M و C في حالتنا) بواسطة PCR واستنساخها في ناقلات الإدخال المناسبة (على سبيل المثال، pENTR/D-TOPO vector؛ انظر الجدول 1 للنواقل المستخدمة في هذه التجر?...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

ويبين هذا البروتوكول استخدام المقايسة FRET-FLIM التي تستند إلى BIFC للتأكد من تكوين مجمع ترنيري بين مونومرين من بروتين MADS-box وبروتين مستشعر الكالسيوم. تم تكييف البروتوكول من تقرير من قبل Y. جون شيو وآخرون حيث طوروا طريقة FRET المستندة إلى BiFC لتصور المجمع الترنيمي الذي تم تشكيله بين heterodimers Fos-Jun و NFAT ?...

تشكل التفاعلات البروتينية البروتينية (PPIs) أساس الأداء السليم للخلايا النواة من خلال تنظيم مختلف العمليات الأيضية والتنموية. بعض PPIs مستقرة، في حين أن البعض الآخر عابر في طبيعته. يمكن تصنيف التفاعلات بناء على عدد الأعضاء ونوعهم في التفاعل مثل ثنائية، ثلاثية، ثلاثية الأرقام، رباعية الأرقام، وهيتيروميك1. قد يؤدي تحديد وتوصيف التفاعلات البروتينية إلى فهم أفضل لوظائف البروتين والشبكات التنظيمية.
عوامل النسخ هي البروتينات التي تشارك في الوظائف التنظيمية. وهي تنظم معدل نسخ جيناتها المصب عن طريق الربط بالحمض النووي. في بعض الأحيان oligomerization أو تشكيل مجمعات من الدرجة العالية عن طريق البروتينات هو شرط أساسي لتنفيذ وظائفهم2. عوامل النسخ مربع MADS النباتية هي الجينات المنزلية التي تنظم عمليات مختلفة مثل انتقال الأزهار، وتطوير الأعضاء الأزهار، والإخصاب، وتطوير البذور، والتألق، والتنمية النباتية. ومن المعروف أنها تشكل مجمعات أعلى ترتيبا التي ترتبط الحمض النووي3،4. دراسة شبكات PPI بين عوامل النسخ والمتفاعلين معها يوفر رؤى حول التعقيد الكامن وراء التنظيم النسخي.
تعبير البروتين العابر في نيكوتيانا بنثاميانا كان نهجا شائعا لدراسة توطين البروتين أو التفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي5. BiFC و FRET هي طرق لدراسة التفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي باستخدام أنظمة المراسل الفلورسنت6. وقد ثبت أن مزيجا من هاتين التقنيتين للكشف عن التفاعل بين ثلاثةبروتينات 7. يتم قياس FRET باستخدام تقنية acceptor photobleaching والانبعاثات الحساسة والتصوير مدى الحياة الفلوري (FLIM). وقد برز الفحص FRET القائم على FLIM كأداة توفر التحديد الكمي الدقيق وخصوصية الصدغية ملعقة لقياسات نقل الطاقة بين اثنين من الجزيئات على أساس العمر الفلوري8. يقيس FLIM الوقت الذي يبقى فيه الفلوروفور في حالة متحمسة قبل انبعاث الفوتون وهو أفضل من التقنيات التي تستخدمقياساتالكثافة وحدها 9و10. وإلى جانب أنظمة heterologous مثل نيكوتيانا بنثاميانا وقشور البشرة البصل، أظهرت تقارير أكثر حداثة استخدام جذور Arabidopsis والشتلات الأرز الشباب، وما إلى ذلك، لتحليل في الجسم الحي من التفاعلات البروتين البروتين في ظل الظروفالأصلية 11،12.
وبخلاف نظام التعبير المناسب، فإن اختيار الشركاء المتفاعلين في اختبارات BiFC و FRET أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه التجربة. يجب التحقق من صحة مؤشر أسعار المنتجين بين الشركاء المستخدمين في تكوين BiFC باستخدام عناصر التحكم المناسبة قبل استخدامها كشريك مترافق في تجربة FRET13. يستخدم BiFC الاستكمال الهيكلي للأجزاء N-و C-terminal من البروتين الفلوري. كان القيد الشائع في معظم إن لم يكن كل البروتينات الفلورية المستخدمة في مقايسات BiFC هو التجميع الذاتي بين الشظايا المشتقة غير الفلورية ، مما يساهم في الفلورسنت الإيجابي الزائف ويقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S / N)14. التطورات الأخيرة، بما في ذلك الطفرات نقطة أو موقف تقسيم البروتين الفلورسنت، أدت إلى أزواج BiFC مع زيادة كثافة، وخصوصية أعلى، وارتفاع نسبة S / N15،16. ويمكن أيضا استخدام هذه البروتينات الفلورية لتنفيذ BiFC اعتمادا على مدى ملاءمة التجربة.
تقليديا، وقد استخدمت CFP وYFP كما المانحة والزوج المقبول في التجارب FRET17. ومع ذلك، تم العثور على YFP أو M-Citrine لتكون أفضل المتبرعين FRET (عند استخدامها مع RFP كمقبول) بسبب غلة الكم عالية (QY) خلال التعبير الأصلي من البروتينات المستهدفة في نظام الجذر Arabidopsis. كما يلعب اختيار المروجين (التأسيسيين مقابل الأصليين/المحليين) والفلوروفور دورا حاسما في تصميم تجربة ناجحة بين BiFC-FRET-FLIM. ومن الضروري ملاحظة أن كفاءة الجهات المانحة FRET ومدى ملاءمة أزواج FRET تميل إلى التغير مع التغيير في المروج والنظام البيولوجي المستخدم للتعبير. يعتمد QY للفلوروفور ، الذي يتعلق بسطوعه ، على درجة الحموضة ودرجة الحرارة والنظام البيولوجي قيد الاستخدام. نقترح أن يتم النظر في هذه المعايير بدقة قبل اختيار زوج الفلوروفور لتجربة FRET. النظام البيولوجي، والمروجين، والبروتينات المستخدمة لهذا البروتوكول عملت بشكل جيد مع الفلوروفوريس CFP-YFP لتجربة BIFC FRET-FLIM.
في هذه الدراسة، ونحن دمج ميزة FLIM لتصور التفاعل بين ثلاثة جزيئات البروتين باستخدام BIFC FRET مقرها. في هذه التقنية، يتم وضع علامة اثنين من البروتينات مع البروتين YFP الانقسام والبروتين الثالث مع CFP. منذ كنا مهتمين في دراسة التفاعل بين البروتين MADS مربع (M) homodimer مع بروتين استشعار الكالسيوم (C)، تم وضع علامات هذه البروتينات مع البروتينات الفلورية في pSITE-1CA وpSITE-3CA ناقلات18. اثنين من الشركاء التفاعل، في هذا المقايسة، تم وضع علامات مع N- و C-المحطة أجزاء من YFP في pSPYNE-35S وpSPYCE-35S ناقلات19،ونتائج تفاعلها في إعادة تشكيل YFP الوظيفية التي تعمل كمقبل FRET إلى الشريك التفاعل الثالث، الذي هو الموسومة مع CFP (بوصفها المانحة FRET) (الشكل 1 ). وفي هذه الحالة بالذات، تم التحقق من صحة مؤشر أسعار المنتجين بين اثنين من مونومرات M وبين M و C من خلال أداء BiFC في ثلاثة أنظمة مختلفة جنبا إلى جنب مع نظام الخميرة اثنين الهجين. وقد تم تعبئة هذه النواقل في سلالة Agrobacterium tumifaciens GV3101 عن طريق الكهرومporation. سلالة GV3101 لديه نزع سلاح تي بلازميد pMP90 (pTiC58DT-DNA) مع مقاومة جنتاميسين20. تمت إضافة سلالة البكتيريا الزراعية P19 جنبا إلى جنب مع جميع عمليات التسلل لمنع إسكات المتحولينجنسيا 21. نوصي بأن البروتينات الثلاثة يجب أن تستخدم أيضا في تشكيلات معاكسة للتحقق من صحة التفاعلات الثلاثية.
في هذه التقنية، قمنا بتوظيف FLIM، حيث أولا، يتم قياس عمر المضان للمتبرع (عمر المتبرع غير المروي) في غياب مقبول. بعد ذلك ، يتم قياس عمرها في وجود المقبول (عمر المتبرع المروي). يستخدم هذا الاختلاف في عمر الفلورسينس المانح لحساب كفاءة FRET ، والتي تعتمد على عدد الفوتونات التي تظهر انخفاضا في عمر الفلورية. المذكورة أدناه هو بروتوكول مفصل لتحديد تشكيل مجمع الترنية بين أي ثلاثة بروتينات من خلال التعبير عن عابر البروتينات الموسومة الفلورسنت في نيكوتيانا بنثاميانا وقول تفاعلها من قبل BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

التفاعلات البروتين البروتين هي جزء لا يتجزأ من جميع العمليات البيولوجية في الخلايا لأنها تلعب دورا حاسما في تنظيم وصيانة وتعديل الوظائف الخلوية. وتشارك هذه التفاعلات في مجموعة واسعة من الظواهر مثل نقل الإشارات، والاستجابة لمسببات الأمراض، والتفاعلات بين الخلايا الخلوية، والعمليات الأيضية والتنموية. وفي حالة عوامل النسخ، قد تؤدي هذه التفاعلات إلى احتكار الوحدات الفرعية، وعزلها في سياقات فرعية محددة مثل النواة والسيتوبلازم وما إلى ذلك، والتي بدورها قد يكون لها تأثير أكثر عمقا على التعبير عن جينات المصب. هنا، ونحن نظهر منهجية لتصور في التفاعل الثلاثي في الجسم الحي باستخدام استكمال الفلورية البيموليكية (BiFC) مقرها Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) التي تنطوي على التصوير مدى الحياة الفلورية (FLIM). يتفاعل اثنان من البروتينات المختارة لهذه المظاهرة كشركاء BiFC ، ويستخدم نشاط الفلورسينس المعاد تشكيله لإجراء فحص FRET-FLIM مع الشريك الثالث. وقد استخدمت أربعة إلى خمسة أسابيع من العمر نمو غرفة نمت مصانع نيكوتيانا بنثاميانا كنظام مصنع نموذجي لهذا العرض التوضيحي.

يمثل هذا البروتوكول طريقة محسنة للدراسة في التفاعلات الثلاثية للبروتين والبروتين في النباتات. المبدأ الأساسي للبروتوكول هو الجمع بين اثنين من تقنيات التفاعل البروتين الموسومة بالفلورسينس، أي BiFC و FRET، لإنشاء مقايسة لقياس التكوين المعقد الترني بين ثلاثة شركاء البروتين. هنا، استخدمن...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

هنا نقدم، طريقة لتصور تشكيل معقدة الترنية بين ثلاثة شركاء البروتين باستخدام البروتينات الموسومة الفلورسنت من قبل BiFC مقرها FRET-FLIM المقايسة. هذه الطريقة قيمة لدراسة مجمعات التفاعل البروتين البروتين في الجسم الحي.

تحديد التفاعل الثلاثي بين اثنين من مونومرات من عامل النسخ MADS مربع وبروتين استشعار الكالسيوم من قبل BiFC-FRET-FLIM المقايسة

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

توفر دراسة التفاعلات البروتينية البروتينية فهما لتنظيم العديد من العمليات البيولوجية. هنا نحن نثبت إجراء وصفها الأولي من قبل Y جون الأحذية وشركاه. العمال في عام 2007، حيث استخدم المؤلفون BiFC بالاشتراك مع FRET للتحقق من التفاعل الثلاثي بين ثلاثة جزيئات بروتين.ومع ذلك، قمنا بتضمين قياسات العمر الفلوري في هذا الإجراء لإثبات قياسات FRET. ولإظهار تفاعل ثلاثي، اخترنا بروتينا معروفا بالتجانس. وعلاوة على ذلك، فقد تم التحقق من صحتها أيضا في المنزل للتفاعل مع جهاز استشعار الكالسيوم من البروتين المشار إليها باسم بروتين C في هذا البروتوكول.تتفاعل بروتينات MNC في السيتوبلازم. في هذه التقنية، يتم وضع علامة اثنين من البروتينات مع البروتينات YFP الانقسام. يؤدي تفاعلها إلى رد YFP الوظيفية التي تعمل كمقبل FRET إلى الشريك التفاعل الثالث ، والتي يتم وضع علامة عليها مع CFP بوصفها المانح FRET.ابدأ بتضخيم تسلسلات الترميز للجينات ذات الاهتمام التي هي جينات M و C في حالتنا بواسطة PCR واستنساخها في ناقلات الدخول المناسبة. التحقق من صحة المستنسخات التي يتم تحديدها على المضادات الحيوية التي تحتوي على لوحات عن طريق تقييد الهضم وتسلسل الحمض النووي. تعبئة CDS'from استنساخ الإدخال المعاد تشكيله إلى متجهات الوجهة.جميع المتجهات المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في الجدول الأول. وأخيرا، تحويل الخلايا GV3101 البكتيريا الزراعية مع ناقلات الوجهة عن طريق الكهرومporation. هنا نزرع نباتات نيكوتيانا بنثاميانا لا تزال أربعة إلى ستة مرحلة إجازة في ظروف خاضعة للرقابة في غرفة النمو.إعداد مزيج التربة عن طريق خلط التربة، كوكو الخث والسماد في نسبة 2:1:1. نشر طبقة سميكة بوصة واحدة من هذا المزيج في صينية بلاستيكية لجعل سرير التربة وتشبع مع القليل من الماء. رش حوالي 200 بذور على رأس التربة ونقلها إلى صينية أكبر أن حوالي سنتيمتر واحد من المياه الراكدة.تغطية هذه الدرج مع غلاف بلاستيكي لإنشاء غرفة الرطوبة. نقل هذه الدرجة إلى غرفة تنمو تعيين في 23 درجة مئوية مع ضوء 16 ساعة ودورة مظلمة لمدة ثماني ساعات. بعد أسبوعين نقل الشتلات الشباب إلى الأواني الصغيرة 3-4 بوصة تحتوي على مزيج التربة المشبعة بالماء.ضع هذه الأواني في صواني بلاستيكية ونقلها لتنمو الغرفة لمدة أربعة أسابيع أخرى. بالنسبة للترشيح الزراعي ، تحتاج السلالات البكتيرية إلى أن تكون طازجة شبه مثقفة ومختلطة جنبا إلى جنب مع سلالة P19 من البكتيريا الزراعية بنسب مناسبة. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تلقيح سلالات البكتيريا الزراعية GV3101 التي تحتوي على بي إف سي و FRET من لوحات متتالية في 10 مل.إلى مرق تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. جنبا إلى جنب، أيضا بدء ثقافة سلالة P19 من البكتيريا الزراعية، والتي تضاف لمنع إسكات المتحولين جنسيا. تغطية القارورة مع رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في شاكر حاضنة، تعيينها 28 درجة مئوية في 170 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.بعد نقل النمو بين عشية وضحاها 1 مل من هذه الثقافات إلى تكعيبية المتاح لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر باستخدام مطياف. مزيج ثقافات مناسبة BiFC و FRET شريك يحتوي على سلالات بحيث OD النهائي هو 0.5 وذلك من P19 هو 0.3 في حجم إجمالي قدره 2 مل.لتحقيق هذه النسب نتبع الصيغة المعروضة على الشاشة لهذه الحسابات. الطرد المركزي الثقافات الزراعية المختلطة في 3000G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل بعناية supernatant. تعليق الكريات في 2 مل.حاجز التسلل. قد تضطر إلى استخدام خلاط دوامة لإعادة تعليق الخلايا في تعليق الخلية متجانسة تماما. بعد هذا احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاث ساعات.وفي الوقت نفسه، تسمية كل وعاء النبات لخليط بناء انها ستعمل يكون تسللت مع. ملء حقنة 1 مل. إبرة مع مزيج البكتيريا الزراعية.بلطف ولكن بحزم اضغط على طرف حقنة إلى الجانب abaxial من ورقة موسعة تماما في حين دعم ورقة من الجانب الآخر. ادفع المكبس برفق حتى يملأ المحلول في مساحة الورقة ما يعادل مرتين إلى ثلاث مرات كما هو الحال في طرف الحقنة. التسلل إلى المزيج البكتيري في ما يصل إلى أربعة بقع على ورقة واحدة وتكرار هذا الإجراء لمدة ثلاث إلى أربع أوراق لنوع واحد من التسلل.أيضا، وتشمل ما لا يقل عن اثنين من النباتات لكل بناء للتسلل. تذكر أن تمسح يديك ب 70٪ كحول أو تغير قفازاتك لمنع أي تلوث متقاطع. نقل جميع الأواني إلى صينية واحتضان في غرفة النمو في نفس حالة النمو.تحقق من جزء صغير من ورقة agroinfiltrated باستخدام المجهر الفلوري. عندما تكون الفلورية من كل من YFP وCFP قابلة للكشف في الخلايا المضي قدما إلى المجهر confocal ل BIFC FRET-FLIM المقايسة. في حالتنا، تم إجراء هذا التحليل بعد ثلاثة أيام من الترشيح الزراعي.الآن أن النباتات على استعداد لتصور تحت المجهر قطع عينات ورقة مربعة من خمسة إلى 8 ملم بعيدا عن الجرح طرف حقنة وجبل لهم على الماء المقطر. ضع غطاء نظيفا فوقها وختم.تصور هذه العينات في المجهر المسح بالليزر confocal. في هذا الإجراء، أساس تحديد وقياس التفاعل بين اثنين من البروتينات هو الحد من العمر الفلوري للشريك المانح FRET عند تفاعله مع المقبول، والذي يستخدم لحساب كفاءة FRET. التعقيد في حالة التفاعل الثلاثي يزيد أكثر لأن FRET acceptor في هذه الحالة ليس جزيء واحد ، ولكن زوج YFP BiFC المنقسم ، والذي يجب أولا إعادة تشكيله في الجسم الحي ليصبح متقبلا وظيفيا ل FRET fluorophore.لتنفيذ FRET-FLIM، علينا أن نحدد مدى الحياة الجزيئات المانحة مضان، أولا وحدها ومن ثم في وجود شريك FRET. افتح تطبيق FLIM في مجهر المسح بالليزر البؤري، وابدأ وحدة التحكم واستخدم عد فوتون التعرف على الأنماط لقياس عمر الفلورسينس. حدد وضع قياس عد جميع فوتونات القياسية.سنأخذ نوعين من النباتات الزراعية المصفاة. واحد يحتوي على جين CCFP والآخر يحتوي على CCFP جنبا إلى جنب مع MYFP لأن التفاعل من بروتين M قد تم التحقق من صحته بالفعل مع بروتين C باستخدام BiFC و Y2H ، نتوقع كفاءة جيدة FRET مع هذا الزوج المتفاعل. الآن نحن أول مسح ورقة CCFP agroinfiltrated والبحث عن خلية تظهر مضان CFP جيدة.يتم عرض إعدادات المجهر على الشاشة. يتم إضاءة العينة بقوة ليزر كافية لتحقيق ما يقرب من 0.1 فوتون لكل نبضة. بالنسبة للعينات ذات كثافة الفلورية المتغيرة، سنقوم بالتقاط 50 إطارا لجمع الفوتونات الكافية اللازمة لقياس مدى الحياة.كما هو معروف CFP لعرض اثنين من العمر الفلورية بسبب التكيف التأكيدي، ونحن تغذية البيانات باستخدام نموذج إعادة تعقيدا الأسي مع الحفاظ على قيمة N يساوي اثنين. في هذه الإعدادات، تكون عمران مرئيتين في واحد و 3.2 نانو ثانية. سوف نستخدم عمر أعلى لجميع الحسابات اللاحقة.نحن الآن على استعداد لقياس FRET بين CCFP و MYFP. لهذا دعونا استخدام عينة ورقة من مصنع agroinfiltrated مع CCFP و MYFP. نحن نبحث عن الخلية التي تعبر عن كل من CCFP و MYFP وتأكيد أنماط الانبعاثات الخاصة بهم من خلال إثارة لهم باستخدام كامل 40 نانومتر نبض الليزر و 514 نانومتر ليزر الضوء الأبيض.بعد ذلك ننتقل إلى وحدة تحكم FLIM لقياس عمر CFP باستخدام نفس الإعدادات التي استخدمناها سابقا لقياس عمر CCFP. ولكن هذه المرة الخلية هو أيضا التعبير عن MYFP التي يمكن أن تتفاعل مع CCFP وتسبب انخفاضا في عمر CCFP. كما قرأنا الرسم البياني الذي تم الحصول عليه باستخدام نموذج إعادة تعقيدا N الأسي مع N يساوي اثنين ، هناك في الواقع انخفاض في عمر CFP من 3.2 إلى 2.6 نانو ثانية.نبدأ الآن وحدة التحكم FRET في البرنامج وحساب كفاءة FRET عن طريق إدخال يدويا مدى الحياة لا يرقى إليه الشك في المعادلة المقدمة في البرنامج والكفاءة FRET لوحظ هو 56٪ الآن دعونا ننتقل إلى الخطوة النهائية، وهذا هو تصور التفاعل بين ثلاثة شركاء. لهذا، ونحن نأخذ عينة ورقة من النبات الذي كان تسللت مع CCFP و MYFPN مع MYFPC. نحن مسح نبات ورقة لخلية الذي يظهر كل من CFP وإعادة تشكيلها YFP الفلورسينس المنبثقة من التفاعل بين اثنين من البروتينات M.نحن نستخدم نفس الطول الموجي الليزر والانبعاثات كما استخدمت في وقت سابق. في وقت لاحق، ونحن إيقاف الليزر 514 نانومتر والانتقال إلى وحدة التحكم FLIM. إذا كان DIMER MYFP يتفاعل مع CCFP.وينبغي أن نرى انخفاضا في عمر CCFP كما لوحظ خلال تفاعلها مع MYFP. ومع ذلك ، إذا فشل CCFP في التفاعل مع جهاز MYFP dimer ، فيجب أن يظل عمر الفلورسينس الخاص به عند 3.2 نانو ثانية. باستخدام إعدادات مماثلة كما ذكر أعلاه، ونحن قياس مدى الحياة CFP في وجود YFP المعاد تشكيلها.نحن تناسب الرسم البياني باستخدام نموذج N إعادة تعقيدا أسي مع يساوي اثنين والانتقال إلى وحدة التحكم FRET. ونعم هناك انخفاض في عمر CFP من 3.2 إلى 2.3 نانو ثانية. نحن حساب كفاءة FRET كما هو موضح أعلاه.كفاءة FRET المحسوبة هي 55٪ هنا استخدمنا FLIM لقياس عمر الفلورية للشريك المانح FRET في وجود وغياب مقبول FRET. وكان من المتوقع حدوث انخفاض في عمر المتبرع الفلوري إذا كان هناك تفاعل إيجابي بين البروتينين. في حالة وجود سيطرة إيجابية ، وهذا هو CCFP و MYFP.نلاحظ انخفاضا في عمر الفلورية للمتبرع من 3.3 إلى 2.5 نانو ثانية وكانت كفاءة FRET 56٪ وأسفرت عملية مماثلة مع YFP المعاد تشكيلها عن التفاعل بين اثنين من الأمونوميرات والبروتينات C أيضا عن تفاعل إيجابي FRET مما أدى إلى انخفاض عمر المضان للمتبرع إلى 2.6 نانو ثانية. وكانت كفاءة FRET المحسوبة حوالي 55٪ في هذه الحالة. انخفاض العمر الفلوري للمتبرع FRET يوفر دليلا قويا على التفاعل الثلاثي بين هذه البروتينات.البروتوكول الموصوف هنا هو أداة قوية لتحديد التفاعلات الثلاثية بين البروتين والبروتين في الخلايا الحية. يمكن أن يساعد هذا الإجراء أيضا في تحديد التعريب داخل الخلايا للمجمعات الناتجة ، وهو أمر مهم في فك شفرة الوظيفة والأهمية الفسيولوجية لأي مجمع بروتين. في الختام، يوفر اختبار FRET-FLIM القائم على BIFC فرصة لدراسة وتوصيف الجوانب الهامة من التفاعلات الثلاثية للبروتين، والتي يمكن أن تكون مفيدة في دراسات التفاعل بين البروتين والبروتين في كل من النظم الحيوانية والنباتية.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...