Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB， GG， SB， KC衷心感谢大学教育资助委员会（UGC）、UGC-BSR、DBT-INSPIRE和科学与工业研究委员会（CSIR）的研究奖学金。我们感谢印度政府生物技术部（DBT），印度政府，科学技术部（DST-FIST），印度政府的财政支持。

1. 入口和目的地载体中的基因克隆（图2）
<ol><li>通过PCR扩增目标基因（我们的例子中为M和C基因）的编码序列（CDS），并将其克隆到适当的入口载体（例如，pENTR / D-TOPO载体;有关本实验中使用的向量，请参见表1）。</li>
	<li>在含有抗生素的平板上培养克隆。通过限制性消化和DNA测序验证在抗生素上选择的克隆22，23?...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. 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F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

本方案展示了使用基于BiFC的FRET-FLIM测定来确定MADS盒蛋白和钙传感器蛋白的两个单体之间形成三元络合物。该协议改编自Y. John Shyu等人的一份报告，他们开发了一种基于BiFC的FRET方法，以可视化Fos-Jun异源二聚体和NFAT或p65之间形成的三元复合物，使用敏化发射方法7。早些时候，Galperin和同事们在2004年29年开发了一种三荧光团FRET系统，但它需要六个滤光片，其中包...

蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）通过调节各种代谢和发育过程，构成了真核细胞正常运作的基础。一些PPI是稳定的，而另一些则是瞬态的。相互作用可以根据相互作用中成员的数量和类型进行分类，例如二聚体，三聚体，四聚体同聚体和异构体1。蛋白质相互作用的鉴定和表征可能导致对蛋白质功能和调节网络的更好理解。
转录因子是参与调节功能的蛋白质。它们通过与DNA结合来调节其下游基因的转录速率。有时蛋白质低聚或形成高阶复合物是执行其功能的先决条件2。植物MADS盒转录因子是同源基因，调节各种过程，如花移，花器官发育，受精，种子发育，衰老和营养发育。已知它们形成与DNA3，4结合的高阶复合物。研究转录因子及其相互作用者之间的PPI网络可以深入了解转录调控的复杂性。
Nicotiana benthamiana中的瞬时蛋白表达一直是研究体内蛋白质定位或蛋白质 - 蛋白质相互作用的流行方法5。BiFC和FRET是使用荧光报告系统6在体内研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的方法。这两种技术的组合已被证明可以揭示三种蛋白质之间的相互作用7。使用受体光漂白，敏化发射和荧光寿命成像（FLIM）技术测量FRET。基于FLIM的FRET测定已成为一种工具，可以根据其荧光寿命为两个分子之间的能量转移测量提供准确的定量和时空特异性8。FLIM测量荧光团在发射光子之前保持激发态的时间，并且比仅使用强度测量的技术更好9，10。除了异源系统，如Nicotiana benthamiana和洋葱表皮皮，最近的报告已经证明使用拟南芥根和年轻的水稻幼苗等，在天然条件下进行蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内分析11，12。
除了合适的表达系统外，选择用于BiFC和FRET测定的相互作用伙伴对于该实验的成功也至关重要。在使用FRET实验13中的共轭伙伴之前，应使用适当的对照来验证BiFC配置中使用的伙伴之间的PPI。BiFC利用荧光蛋白的N端和C端部分的结构互补。BiFC测定中使用的大多数（如果不是全部）荧光蛋白的一个共同限制是两个衍生的非荧光片段之间的自组装，导致假阳性荧光并降低信噪比（S /N）14。最近的发展，包括点突变或分裂荧光蛋白的位置，已经产生了具有更高强度，更高特异性，高S / N比15，16的BiFC对。这些荧光蛋白也可用于进行BiFC，具体取决于实验的适用性。
传统上，CFP和YFP在FRET实验17中被用作供体和受体对。然而，YFP或m-Citrine被发现是更好的FRET供体（当与RFP一起使用时作为受体使用时），因为在 拟南芥 根系中靶蛋白的天然表达过程中具有高量子产率（QY）。启动子（本构与天然/内源性）和荧光团的选择在设计成功的BiFC-FRET-FLIM实验中也起着至关重要的作用。必须注意的是，FRET供体的效率和FRET对的适宜性往往随着启动子和用于表达的生物系统的变化而变化。荧光团的QY与其亮度有关，取决于pH值，温度和使用的生物系统。我们建议在为FRET实验选择荧光团对之前彻底考虑这些标准。用于该方案的生物系统，启动子和蛋白质与CFP-YFP荧光团一起用于BiFC FRET-FLIM实验。
在本研究中，我们结合FLIM的特征，使用基于BiFC的FRET可视化三个蛋白质分子之间的相互作用。在该技术中，两种蛋白质用分裂的YFP蛋白标记，第三种蛋白质用CFP标记。由于我们有兴趣研究MADS盒蛋白（M）同源二聚体与钙传感器蛋白（C）的相互作用，因此这些蛋白在pSITE-1CA和pSITE-3CA载体18中用荧光蛋白标记。在该测定中，两个相互作用的伙伴在pSPYNE-35S和pSPYCE-35S载体19中用YFP的N端和C端部分标记，它们的相互作用导致功能YFP的重建，该功能YFP作为FRET受体到第三个相互作用伙伴，其用CFP标记（作为FRET供体）（图1）).在这种特殊情况下，两个M单体之间以及M和C之间的PPI已经通过在三个不同的系统中执行BiFC以及酵母双杂交系统进行了验证。这些载体通过电穿孔动员成 农杆菌Tumifaciens GV3101菌株。GV3101菌株具有解除武装的Ti质粒pMP90（pTiC58DT-DNA），具有庆大霉素耐药性20。将p19 农杆菌 菌株与所有浸润一起加入，以防止转基因沉默21。我们建议这三种蛋白质也应该以相反的构象使用，以验证三方相互作用。
在该技术中，我们采用了FLIM，其中首先，在没有受体的情况下测量供体的荧光寿命（未淬灭的供体寿命）。之后，在受体存在的情况下测量其寿命（淬灭供体寿命）。供体荧光寿命的这种差异用于计算FRET效率，这取决于荧光寿命缩短的光子数量。下面提到的是一个详细的方案，通过瞬时表达 Nicotiana benthamiana 中的荧光标记蛋白并通过BiFC-FRET-FLIM测定它们的相互作用来确定任何三元复合物之间三元复合物的形成。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

蛋白质 - 蛋白质相互作用是细胞中所有生物过程的组成部分，因为它们在调节，维持和修改细胞功能方面起着至关重要的作用。这些相互作用涉及广泛的现象，如信号转导，病原体反应，细胞 - 细胞相互作用，代谢和发育过程。在转录因子的情况下，这些相互作用可能导致亚基的寡聚化，在特定的亚细胞环境中隔离，如细胞核，细胞质等，这反过来又可能对下游基因的表达产生更深远的影响。在这里，我们展示了一种使用基于双分子荧光互补（BiFC）的Förster共振能量转移（FRET）可视化 体内 三方相互作用的方法，涉及荧光寿命成像（FLIM）。为本演示选择的两种蛋白质作为BiFC伙伴相互作用，并且它们重建的荧光活性用于与第三个伙伴测定FRET-FLIM。四到五周龄的生长室生长的 Nicotiana benthamiana 植物已被用作该演示的示范植物系统。

该协议代表了研究植物 体内 三方蛋白质 - 蛋白质相互作用的优化方法。该协议的基本原理是结合两种荧光标记的蛋白质相互作用技术，即BiFC和FRET，以创建一种测定方法来测量三种蛋白质伴侣之间的三元复合物形成。在这里，我们使用FLIM来测量FRET供体伴侣在存在和不存在FRET受体的情况下的荧光寿命。如果两种蛋白质之间存在正相互作用，则预计供体的荧光寿命会缩短。我们从测量供体的...

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Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

在这里，我们提出了一种通过基于BiFC的FRET-FLIM测定使用荧光标记蛋白可视化三元复合物形成的方法。该方法对于研究 体内蛋白质 - 蛋白质相互作用复合物很有价值。

通过BiFC-FRET-FLIM测定MADS盒转录因子和钙传感器蛋白两种单体之间的三方相互作用

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究提供了对许多生物过程调节的理解。在这里，我们演示了Y John shoe and co描述的初始程序。2007年，作者使用BiFC与FRET组合来验证三种蛋白质分子之间的三方相互作用。然而，我们在此程序中包括荧光寿命测量，以证实FRET测量。为了证明三方相互作用，我们选择了一种已知同源二聚化的蛋白质。此外，它还经过内部验证，可与该方案中称为C蛋白的蛋白质钙传感器相互作用。MNC蛋白在细胞质中相互作用。在该技术中，两种蛋白质被标记为分裂的YFP蛋白。它们的相互作用导致作为FRET受体的功能性YFP恢复到第三个相互作用的伴侣，该伴侣被标记为CFP作为FRET供体。首先通过PCR扩增目标基因的编码序列，这些基因是我们的例子中的M和C基因，并将其克隆到适当的入口载体中。通过限制性酶切和DNA测序验证在含有平板的抗生素上选择的克隆。将重组的 CDS 从入口克隆转移到目标载体。本实验中使用的所有载体均列于表一。最后，通过电穿孔将农杆菌GV3101细胞与目标载体进行转化。在这里，我们种植了Nicotiana Benthamiana植物，在生长室的受控条件下，仍然有四到六个离开阶段。通过以2：1：1的比例混合土晶，椰子泥炭和堆肥来制备土壤混合物。在塑料托盘中铺上一英寸厚的这种混合物层，制成土床并用少量水浸透。在土壤上撒上大约200颗种子，然后将其转移到一个更大的托盘中，大约一厘米的积水。用保鲜膜盖住此托盘以形成防潮室。将此托盘转移到设置在23摄氏度的生长室中，具有16小时的光照和8小时的黑暗循环。两周后，将幼苗转移到含有水饱和土壤混合物的三到四英寸的小花盆中。将这些花盆放在塑料托盘中，然后将它们转移到生长室中再生长四周。对于农用过滤，细菌菌株需要新鲜亚培养并以适当的比例与P19农药菌株混合。通过接种含有10ml条纹板的BiFC和FRET构建物的GV3101农杆菌菌株来开始该过程。到含有适当抗生素的肉汤。同时，还要启动P19农杆菌菌株的培养，添加该菌株以防止转基因沉默。用铝箔盖住烧瓶，并将它们放在培养箱振荡器中，将其设置为28摄氏度，转速为170 RPM，持续16小时。过夜生长后，使用分光光度计将这些培养物的1ml转移到一次性肘部以测量600纳米处的光密度。混合含有菌株的适当BiFC和FRET伴侣的培养物，使最终OD为0.5，P19的OD为0.3，总体积为2ml。为了达到这些比率，我们按照屏幕上显示的公式进行这些计算。在室温下将混合的农杆菌培养物以3000G离心五分钟，并小心地丢弃上清液。将颗粒悬浮在2毫升中。浸润缓冲液。您可能需要使用涡流混合器将细胞完全悬浮在均质细胞悬浮液中。之后，将管子在室温下在黑暗中孵育三个小时。同时，在每个花盆上贴上要渗透的混合物的标签。用农用细菌混合物填充1ml无针注射器。轻轻但牢固地将注射器尖端压到完全膨胀的叶子的轴侧，同时从另一侧支撑叶子。轻轻推动柱塞，直到溶液在叶片区域中充满，相当于注射器尖端的两到三倍。将细菌混合物浸润在一片叶子上最多四个斑点处，并重复此过程，以获得三到四片叶子以进行一种浸润。此外，每个构造至少包括两个用于渗透的植物。记得用70%的酒精擦拭双手或更换手套，以防止任何交叉污染。将所有花盆转移到托盘中，并在相同的生长条件下在生长室中孵育。使用荧光显微镜检查农业渗透叶片的一小部分。当来自YFP和CFP的荧光在细胞中可检测到时，进入共聚焦显微镜进行BiFC FRET-FLIM测定。在我们的案例中，该分析是在农业渗透后三天进行的。现在，植物已经准备好在显微镜下可视化，将方形叶样品从注射器尖端伤口处切出5至8毫米，然后将其安装在蒸馏水上。将干净的盖子滑过并密封。在共聚焦激光扫描显微镜中可视化这些样品。在该过程中，确定和量化两种蛋白质之间相互作用的基础是FRET供体伴侣与受体相互作用时荧光寿命的缩短，这用于计算FRET的效率。三方相互作用情况下的复杂性进一步增加，因为在这种情况下，FRET受体不是单个分子，而是分裂的YFP BiFC对，它应该首先在体内重建，成为功能性FRET受体荧光团。为了进行FRET-FLIM，我们必须确定供体分子的荧光寿命，首先是单独使用，然后在FRET伴侣在场的情况下。在共聚焦激光扫描显微镜中打开FLIM应用程序，启动控制台并使用模式识别光子计数来测量荧光寿命。选择标准的全光子计数测量模式。我们将采用两种类型的农业渗透植物。一个具有CCFP基因，另一个具有CCFP和MYFP，因为M蛋白的相互作用已经使用BiFC和Y2H与C蛋白进行了验证，我们期望这种相互作用对具有良好的FRET效率。现在，我们首先扫描CCFP农浸润叶片，寻找显示出良好CFP荧光的细胞。显微镜设置显示在屏幕上。样品以足够的激光功率照射，以达到每脉冲约0.1光子。对于具有可变荧光强度的样品，我们将捕获50帧以收集生命周期测量所需的足够光子。由于已知CFP由于其确认适应性而表现出两个荧光寿命，因此我们使用指数重卷积模型提供数据，同时保持N的值等于2。在这些设置下，两个生存期在 1 秒和 3.2 纳秒时可见。我们将对所有后续计算使用更高的生存期。我们现在准备测量CCFP和MYFP之间的FRET。为此，让我们使用来自具有CCFP和MYFP的农业渗透植物的叶片样本。我们寻找一种同时表达CCFP和MYFP的电池，并通过使用全40纳米脉冲激光器和514纳米白光激光器激发它们来确认它们各自的发射模式。之后，我们切换到 FLIM 控制台，使用与之前用于测量 CCFP 寿命的相同设置来测量 CFP 的生存期。但这一次，细胞也表达了MYFP，这可能与CCFP相互作用，并导致CCFP寿命缩短。正如我们已经阅读了使用N指数再卷积模型获得的图，其中N等于2，实际上CFP寿命从3.2减少到2.6纳秒。现在，我们在软件中启动 FRET 控制台，通过在软件提供的等式中手动输入无可置疑的寿命来计算 FRET 效率，观察到的 FRET 效率为 56%，现在让我们进入最后一步，即可视化三个合作伙伴之间的交互。为此，我们从与CCFP和MYFPN与MYFPC共同浸润的植物中取出叶子样本。我们扫描叶片植物的细胞，该细胞显示CFP和重组的YFP荧光从两个M蛋白之间的相互作用中发出。我们使用与之前相同的激光和发射波长。随后，我们关闭了514纳米激光器并移至FLIM控制台。如果 MYFP 二聚体与 CCFP 相互作用。我们应该看到CCFP的寿命缩短，正如在与MYFP相互作用期间观察到的那样。然而，如果CCFP未能与MYFP二聚体相互作用，其荧光寿命应保持在3.2纳秒。使用上面提到的类似设置，我们在存在重组的YFP的情况下测量CFP寿命。我们使用等于 2 的 N 指数重卷模型拟合图，然后移动到 FRET 控制台。是的，CFP寿命从3.2纳秒下降到2.3纳秒。我们如上所述计算 FRET 效率。计算出的FRET效率为55%，在这里我们使用FLIM来测量FRET供体伴侣在存在和不存在FRET受体的情况下的荧光寿命。如果两种蛋白质之间存在正相互作用，则预计供体的荧光寿命会缩短。在阳性对照的情况下，即CCFP和MYFP。我们观察到供体的荧光寿命从3.3减少到2.5纳秒，FRET效率为56%由于两个单体和C蛋白之间的相互作用而导致的重组YFP的类似运动也导致了积极的FRET相互作用，导致供体的荧光寿命减少到2.6纳秒。在这种情况下，计算出的FRET效率约为55%。FRET供体荧光寿命的缩短为这些蛋白质之间的三方相互作用提供了强有力的证据。这里描述的方案是确定活细胞中三方蛋白质 - 蛋白质相互作用的强大工具。该过程还可以帮助确定所得复合物的细胞内定位，这对于破译任何蛋白质复合物的功能和生理意义非常重要。总之，基于BiFC的FRET-FLIM测定为研究和表征三方蛋白质相互作用的重要方面提供了机会，这可能有助于动物和植物系统中的蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

重新用四个转录因子的小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的产生，强力霉素诱导慢病毒转导系统

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

科研

生物学

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

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Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

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