Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC oprigtigt takke University Grants Kommissionen (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE, og Rådet for Videnskabelig og Industriel Forskning (CSIR) for deres forskning stipendier. Vi anerkender heldigvis Department of Biotechnology (DBT), Government of India, Department of Science and Technology (DST-FIST), Indiens regering for finansiel støtte.

1. Kloning af gener i ind- og destinationsvektorer (figur 2)
<ol><li>Forstærke kodning sekvens (CDS) af de gener af interesse (M og C gener i vores tilfælde) af PCR og klone dem i passende indrejse vektorer (f.eks pENTR/D-TOPO vektor; se tabel 1 for vektorer, der bruges i dette eksperiment).</li>
	<li>Dyrk klonerne på plader, der indeholder antibiotika. Valider kloner, der er udvalgt på antibiotika ved at begrænse fordøjelse...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

Denne protokol viser brugen af BiFC-baseret FRET-FLIM-analyse til at fastslå dannelsen af etternært kompleks mellem to monomerer af et MADS-box protein og et calciumsensorprotein. Protokollen er tilpasset fra en rapport fra Y. John Shyu et al., hvor de har udviklet en BiFC-baseret FRET-metode til at visualisere ternary kompleks dannet mellem Fos-Jun heterodimers og NFAT eller p65 ved hjælp af den sensibiliserede emissionsmetode7. Tidligere, en tre-fluorophore FRET system blev udviklet af Galper...

Protein-protein interaktioner (PPI) danner grundlag for en velfungerende eukaryote celler ved at regulere forskellige metaboliske og udviklingsmæssige processer. Nogle PPI er stabile, mens andre er forbigående. Interaktionerne kan kategoriseres ud fra antallet og typen af medlemmer i interaktionen, f.eks. Identifikation og karakterisering af proteininteraktioner kan føre til en bedre forståelse af proteinfunktioner og reguleringsmæssige netværk.
Transskriptionsfaktorer er proteiner, der er involveret i regulatoriske funktioner. De regulerer hastigheden af transskription af deres downstream gener ved at binde sig til DNA. Sommetider oligomerisering eller dannelse af højere orden komplekser af proteiner er en forudsætning for at udføre deres funktioner2. Plant MADS-box transskription faktorer er homeotiske gener, der regulerer forskellige processer såsom blomster overgang, blomster organ udvikling, befrugtning, frø udvikling, senescence, og vegetativ udvikling. De er kendt for at danne højere orden komplekser, der binder sig til DNA3,4. Undersøgelse ppi netværk blandt transskription faktorer og deres interactors giver indsigt i kompleksiteten underliggende transskription regulering.
Forbigående protein udtryk i Nicotiana benthamiana har været en populær tilgang til at studere protein lokalisering eller protein-protein interaktioner in vivo5. BiFC og FRET er metoder til at studere protein-protein interaktioner in vivo ved hjælp af fluorescerende reporter systemer6. En kombination af disse to teknikker har vist sig at afsløre samspillet mellem tre proteiner7. FRET måles ved hjælp af acceptor photobleaching, sensibiliseret emission, og Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) teknik. FLIM-baserede FRET assay har vist sig som et værktøj, der giver præcis kvantificering og spatiotemporal specificitet til energioverførsel målinger mellem to molekyler baseret på deres fluorescens levetid8. FLIM måler den tid, en fluorophore forbliver i en ophidset tilstand, før udsender en foton og er bedre end teknikker, der bruger intensitet målinger alene9,10. Ud over heterologe systemer som Nicotiana benthamiana og løg epidermal peelinger, nyere rapporter har vist brugen af Arabidopsis rødder og unge risplanter, osv., for in vivo analyse af protein-protein interaktioner under indfødte forhold11,12.
Bortset fra et passende udtrykssystem er udvælgelsen af interagerende partnere til BiFC- og FRET-analyser også afgørende for succesen af dette eksperiment. PPI blandt partnere , der anvendes i BiFC-konfigurationen , bør valideres ved hjælp af passende kontrolelementer, før de anvendes som konjugeret partner i FRET-eksperimentet13. BiFC anvender den strukturelle komplementering af N- og C-terminal dele af fluorescerende protein. En fælles begrænsning i de fleste, hvis ikke alle fluorescerende proteiner, der anvendes i BiFC-analyser, har været selvmonteringen mellem de to afledte ikkefluorescent fragmenter, der bidrager til falsk-positiv fluorescens og reducerer signal-til-støj (S /N) forholdet14. Den seneste udvikling, herunder punktmutationer eller position til opdeling af fluorescerende protein, har givet anledning til BiFC-par med øget intensitet, højere specificitet, højt S /N-forhold15,16. Disse fluorescerende proteiner kan også bruges til at udføre BiFC afhængigt af eksperimentets egnethed.
Traditionelt er den fælles fiskeripolitik og YFP blevet brugt som donor og acceptorpar i FRET-eksperimenter17. Men, YFP eller m-Citrine viste sig at være bedre FRET donorer (når de anvendes med RFP som acceptor) på grund af det høje kvanteudbytte (QY) under den indfødte udtryk for mål proteiner i Arabidopsis rodsystemet. Udvælgelsen af initiativtagere (konstituerende versus indfødte / endogene) og fluorophore spiller også en afgørende rolle i udformningen af en vellykket BiFC-FRET-FLIM eksperiment. Det er vigtigt at bemærke, at FRET-donorernes effektivitet og FRET-pars egnethed har tendens til at ændre sig med ændringen i initiativtageren og det biologiske system, der anvendes til udtryk. QY af fluorophore, som vedrører dens lysstyrke, afhænger af pH, temperatur, og det biologiske system i brug. Vi foreslår, at disse kriterier overvejes grundigt, før du vælger fluorophoreparret til FRET-eksperimentet. Det biologiske system, initiativtagerne og de proteiner, der anvendes til denne protokol, fungerede godt med CFP-YFP fluorophorer til BiFC FRET-FLIM eksperimentet.
I denne undersøgelse inkorporerer vi funktionen af FLIM for at visualisere samspillet mellem tre proteinmolekyler ved hjælp af BiFC-baseret FRET. I denne teknik er to proteiner mærket med split YFP-protein og det tredje protein med cfp. Da vi var interesseret i at studere samspillet mellem en MADS-box protein (M) homodimer med en Calcium sensor protein (C), disse proteiner blev mærket med fluorescerende proteiner i pSITE-1CA og pSITE-3CA vektorer18. To af de interagerende partnere, i denne analyse, blev mærket med N- og C-terminal dele af YFP i pSPYNE-35S og pSPYCE-35S vektorer19, og deres interaktion resulterer i rekonstitution af den funktionelle YFP, der fungerer som en FRET acceptor til den tredje interagerende partner, som er mærket med den fælles fiskeripolitik (fungerer som FRET donor) (Figur 1 ). I dette særlige tilfælde er PPI mellem to M-monomerer og mellem M og C blevet valideret ved at udføre BiFC i tre forskellige systemer sammen med gær-to-hybrid-systemet. Disse vektorer blev mobiliseret i Agrobacterium tumifaciens GV3101 stamme ved elektroporation. GV3101-stammen har en afvæbnet Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens20. En p19 Agrobacterium stamme blev tilføjet sammen med alle infiltrationer for at forhindre transgene lyddæmpning21. Vi anbefaler, at de tre proteiner også anvendes i modsatte konformationer for at validere trepartsinteraktionerne.
I denne teknik har vi anvendt FLIM, hvor donorens fluorescenslevetid (uudslukket donorlevetid) for det første måles i mangel af en acceptor. Derefter måles dens levetid i acceptorens tilstedeværelse (slukket donorlevetid). Denne forskel i donor fluorescens levetid bruges til at beregne FRET effektivitet, som afhænger af antallet af fotoner udviser en reduktion i fluorescens levetid. Nedenfor er en detaljeret protokol til bestemmelse af dannelsen af etternært kompleks mellem tre proteiner ved forbigående at udtrykke fluorescerende-taggede proteiner i Nicotiana benthamiana og analysere deres interaktion med BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Protein-protein interaktioner er en integreret del af alle biologiske processer i cellerne, da de spiller en afgørende rolle i regulering, vedligeholdelse og ændring af cellulære funktioner. Disse interaktioner er involveret i en bred vifte af fænomener såsom signaltransduktion, patogenrespons, cellecelleinteraktioner, metaboliske og udviklingsmæssige processer. I tilfælde af transskriptionsfaktorer kan disse interaktioner føre til oligomerisering af underenheder, binding i specifikke subcellulære sammenhænge som kernen, cytoplasmaet osv., som igen kan have en dybere virkning på ekspressionen af downstream-generne. Her demonstrerer vi en metode til at visualisere in vivo trepartsinteraktion ved hjælp af Bimolekulær Fluorescens Complementation (BiFC) baseret Förster Resonance Energy Transfer (FRET), der involverer Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM). To af de proteiner, der er udvalgt til denne demonstration, interagerer som BiFC-partnere, og deres rekonstituerede fluorescensaktivitet bruges til at analysere FRET-FLIM med den tredje partner. Fire til fem uger gamle vækstkammerdyrkede Nicotiana benthamiana planter er blevet brugt som model plantesystem til denne demonstration.

Denne protokol repræsenterer en optimeret metode til at studere in vivo trepartsprotein-protein interaktioner i planter. Det grundlæggende princip i protokollen er at kombinere to fluorescens-tagged protein-interaktion teknikker, dvs BiFC og FRET, at skabe en analyse til måling af ternary kompleks dannelse mellem tre protein partnere. Her har vi brugt FLIM til at måle FRET-donorpartnerens fluorescenslevetid i FRET-acceptens tilstedeværelse og fravær. En reduktion i donorens fluorescenslevetid var forventet...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Her præsenterer vi, en metode til at visualisere ternary kompleks dannelse mellem tre proteinpartnere ved hjælp af fluorescerende-tagged proteiner ved BiFC baseret FRET-FLIM assay. Denne metode er værdifuld til undersøgelse af protein-protein interaktion komplekser in vivo.

Bestemmelse af trepartsinteraktion mellem to monomerer af en MADS-box transskriptionsfaktor og et calciumsensorprotein ved BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Studiet af protein-protein interaktioner giver en forståelse af reguleringen af mange biologiske processer. Her demonstrerer vi en procedure, der er beskrevet som initial af Y John sko og co. Arbejdere i 2007, hvor forfatterne har brugt BiFC i kombination med FRET til at validere trepartsinteraktionen mellem tre proteinmolekyler.Vi har dog inkluderet fluorescens levetidsmålinger i denne procedure for at underbygge FRET-målinger. For at demonstrere en trepartsinteraktion har vi valgt et protein, som er kendt for at homodimerisere. Desuden er det også blevet valideret internt for at interagere med en calciumsensor af protein kaldet C-protein i denne protokol.MNC-proteinerne interagerer i cytoplasmaet. I denne teknik er to proteiner mærket med opdelte YFP-proteiner. Deres interaktion resulterer i tilbagelevering af funktionel YFP, der fungerer som FRET-acceptor til den tredje interagerende partner, som er mærket med cfp, der fungerer som FRET-donor.Start med forstærkning af kodning sekvenser af de gener af interesse, der er M og C gener i vores tilfælde af PCR og klone dem i passende indrejse vektorer. Valider kloner, der er valgt på antibiotika, der indeholder plader ved begrænsning fordøje og DNA sekventering. Mobilisere den rekonstituerede CDS'fra indgangskloner til destinationsvektorerne.Alle de vektorer, der bruges i dette eksperiment, er angivet i tabel et. Endelig omdanne agrobacterium GV3101 celler med destination vektorer ved elektroporation. Herinde dyrker vi Nicotiana Benthamiana planter stadig fire til seks forlade scenen i kontrollerede forhold i et vækstkammer.Forbered jordblandingen ved at blande jordrit, coco tørv og kompost i et forhold på 2:1:1. Spred et 1-tommer tykt lag af denne blanding i en plastikbakke for at gøre jordbunden og mætte den med lidt vand. Drys omkring 200 frø oven på jorden og overfør det til en større bakke, der omkring en centimeter stående vand.Dæk denne bakke med plastfolie for at skabe et fugtkammer. Overfør denne bakke til et vækstkammer, der er indstillet til 23 grader celsius med 16-timers lys og otte timers mørk cyklus. Efter to uger overføre de unge frøplanter til små tre til fire tommer potter, der indeholder vand mættet jord mix.Placer disse potter i en plastik bakker og overføre dem til at vokse kammer i fire uger mere. For agroinfiltration skal bakteriestammerne være friskunderkulturelle og blandet sammen med P19-stamme af agrobacterium i passende nøgletal. Start denne procedure ved at pode GV3101 agrobacteriumstammer, der indeholder BiFC- og FRET-konstruktioner, fra stribeplader i 10 ml.bouillon, der indeholder passende antibiotika. Ved siden af, også indlede en kultur af P19 stamme af agrobakteri, som tilsættes for at forhindre transgene lyddæmpning. Dæk kolben med aluminiumsfolie og hold dem i en inkubator shaker, sæt den 28 grader celsius ved 170 RPM i 16 timer.Efter natten vækst overførsel 1 ml. af disse kulturer til en engangs alen til at måle den optiske tæthed ved 600 nanometer ved hjælp af et spektrofotometer. Bland kulturer passende BiFC og FRET partner, der indeholder stammer, således at den endelige OD er 0,5 Og at P19 er 0,3 i et samlet volumen på 2 ml.For at opnå disse nøgletal følger vi den formel, der vises på skærmen for disse beregninger. Centrifugere de blandede agrobacterium kulturer ved 3000G i fem minutter ved stuetemperatur og forsigtigt kassere supernatant. Træk pillerne i en 2 ml.infiltrationsbuffer. Du skal muligvis bruge en vortexblander til at suspendere cellerne i en homogen celleaffjedring helt. Efter denne inkubation inkuberes rørene ved stuetemperatur i mørket i tre timer.I mellemtiden, mærke hver plante potte for konstruere blandingen det vil blive infiltreret med. Fyld en 1 ml. nåleløs sprøjte med agrobakteriel blanding.Tryk forsigtigt, men fast på sprøjtespidsen til abaxialsiden af et fuldt udvidet blad, mens du støtter bladet fra den anden side. Skub forsigtigt stemplet, indtil opløsningen fyldes op i bladområdet svarende til to til tre gange som sprøjtespidsen. Infiltrere bakterielle mix på op til fire pletter på et blad og gentage denne procedure for tre til fire blade for en slags infiltration.Omfatter også mindst to anlæg pr. konstruktion til infiltration. Husk at tørre dine hænder med 70% alkohol eller skifte handsker for at forhindre krydskontaminering. Overfør alle potterne til en bakke og inkuber i vækstkammeret i samme væksttilstand.Kontroller en lille del af det agroinfiltrerede blad ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Når fluorescensen fra både YFP og cfp kan påvises i celler, går det konfokale mikroskop til BiFC FRET-FLIM-analysen. I vores tilfælde blev denne analyse udført tre dage efter agroinfiltration.Nu, hvor planterne er klar til at blive visualiseret under et mikroskop skåret firkantede bladprøver fra fem til 8 mm. væk fra sprøjtespids sår og montere dem på destilleret vand. Placer et rent dæksel glide over det og forsegle.Visualiser disse prøver i konfokal laserscanningsmikroskop. I denne procedure er grundlaget for at bestemme og kvantificere interaktion mellem to proteiner reduktionen i FRET-donorpartnerens fluorescenslevetid ved dens interaktion med acceptoren, som bruges til at beregne FRET's effektivitet. Kompleksiteten i tilfælde af trepartsinteraktion øges yderligere, fordi FRET acceptor i dette tilfælde ikke er et enkelt molekyle, men et split YFP BiFC-par, som først skal rekonstitueres in vivo for at blive en funktionel FRET acceptor fluorophore.For at udføre FRET-FLIM skal vi bestemme donormolekylerne fluorescenslevetid, først alene og derefter i nærværelse af en FRET-partner. Åbn FLIM-applikationen i det konfokale laserscanningsmikroskop, start konsollen, og brug mønstergenkendelsesfotontællingen til at måle fluorescenslevetiden. Vælg standard alle fotontællingsmålingstilstand.Vi vil tage to typer af agroinfiltrerede planter. Den ene, der har CCFP-genet og det andet, der har CCFP sammen med MYFP, fordi samspillet mellem M-protein allerede er blevet valideret med C-proteinet ved hjælp af BiFC og Y2H, forventer vi god FRET-effektivitet med dette interagerende par. Nu scanner vi først CCFP-det agroinfiltrerede blad og leder efter en celle, der viser god fFP-fluorescens.Indstillingerne for mikroskop vises på skærmen. Prøven er belyst ved tilstrækkelig lasereffekt til at opnå ca. 0,1 fotoner pr. puls. For prøver med variabel fluorescensintensitet vil vi fange 50 billeder for at indsamle passende fotoner, der kræves til livstidsmålingen.Da den fælles fiskeripolitik er kendt for at udvise to fluorescens levetider på grund af sin konfirmationstilpasning, fodrer vi dataene ved hjælp af en eksponentiel rekonvolutionsmodel, samtidig med at værdien af N holdes lig med to. Ved disse indstillinger er de to levetider synlige på et og 3,2 nanosekunder. Vi bruger den højere levetid til alle efterfølgende beregninger.Vi er nu indstillet til at måle FRET mellem CCFP og MYFP. Til dette lad os bruge bladprøven fra det agroinfiltrerede anlæg med CCFP og MYFP. Vi leder efter en celle, der udtrykker både CCFP og MYFP og bekræfter deres respektive emissionsmønstre ved at spændende dem ved hjælp af fuld 40 nanometer puls laser og 514 nanometer hvidt lys laser.Derefter skifter vi til FLIM-konsollen for at måle levetiden for den fælles fiskeripolitik ved hjælp af de samme indstillinger, som vi brugte tidligere til måling af CCFP's levetid. Men denne gang udtrykker cellen også MYFP, der potentielt kan interagere med CCFP og forårsage en reduktion i CCFP's levetid. Da vi har læst grafen opnået ved hjælp af N eksponentiel rekonvolution model med N lig med to, er der faktisk et fald i den fælles fiskeripolitik levetid fra 3,2 til 2,6 nanosekunder.Vi starter nu FRET-konsollen i softwaren og beregner FRET-effektiviteten ved manuelt at indtaste ubestridelig levetid i den ligning, der leveres i softwaren, og den observerede FRET-effektivitet er 56%Lad os nu gå videre til det sidste trin, det vil sige at visualisere samspillet mellem tre partnere. Til dette tager vi bladprøven fra en plante, der blev infiltreret med CCFP og MYFPN med MYFPC. Vi scanner bladplanten for en celle, der viser både cfp og rekonstitueret YFP fluorescens, der stammer fra interaktion mellem to M proteiner.Vi bruger den samme laser- og emissionsbølgelængde som tidligere. Efterfølgende slukker vi 514 nanometerlaseren og flytter til FLIM-konsollen. Hvis MYFP-dimeren interagerer med CCFP.Vi bør se en reduktion i CCFP's levetid som observeret under dens interaktion med MYFP. Men hvis CCFP ikke interagerer med MYFP dimer, bør dens fluorescens levetid forblive set på 3,2 nanosekunder. Ved hjælp af de lignende indstillinger som nævnt ovenfor måler vi den fælles fiskeripolitiks levetid i nærværelse af rekonstitueret YFP.Vi passer grafen ved hjælp af N eksponentiel rekonvolution model med en lig med to og flytte til FRET konsollen. Og ja, der er et fald i den fælles fiskeripolitiks levetid fra 3,2 til 2,3 nanosekunder. Vi beregner FRET-effektiviteten som beskrevet ovenfor.Den beregnede FRET-effektivitet er 55%Her har vi brugt FLIM til at måle FRET-donorpartnerens fluorescenslevetid i FRET-acceptens tilstedeværelse og fravær. En reduktion i donorens fluorescenslevetid var forventet, hvis der var en positiv interaktion mellem de to proteiner. I tilfælde af positiv kontrol er det CCFP og MYFP.Vi observerer en reduktion i donorens fluorescenslevetid fra 3,3 til 2,5 nanosekunder, og FRET-effektiviteten var 56%En lignende øvelse med rekonstitueret YFP skyldtes samspillet mellem to amonomerer og C-proteiner resulterede også i en positiv FRET-interaktion, der førte til reduktion i donorens fluorescenslevetid til 2,6 nanosekunder. Den beregnede FRET-effektivitet var omkring 55% i dette tilfælde. Reduktionen i FRET-donorens fluorescenslevetid giver et stærkt bevis for en trepartsinteraktion mellem disse proteiner.Protokollen beskrevet her er et kraftfuldt værktøj til at bestemme trepart protein-protein interaktioner i levende celler. Denne procedure kan også hjælpe med at bestemme den intracellulære lokalisering af de resulterende komplekser, hvilket er vigtigt for at dechifrere funktionen og fysiologisk betydning af ethvert proteinkompleks. Afslutningsvis giver BiFC-baseret FRET-FLIM-analyse mulighed for at studere og karakterisere vigtige aspekter af trepartsproteininteraktioner, som kan være nyttige i protein-proteininteraktionsundersøgelser i både dyre- og plantesystemer.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase affinitetsindfangning under anvendelse af magnetiske perler til at studere protein-protein interaktion: poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri metode til Binding Affinity Bestemmelse ved Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Karakterisering af G-protein-koblede receptorer med en fluorescens-baserede calciummobilisering Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Bestemmelse af protein-ligand interaktioner Brug Differential Scanning fluorimetri

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...