Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC bedanken de University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE en Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) oprecht voor hun onderzoeksbeurzen. We erkennen gelukkig het Department of Biotechnology (DBT), government of India, het department of Science and Technology (DST-FIST), government of India voor financiële steun.

1. Klonen van genen in entry- en bestemmingsvectoren (Figuur 2)
<ol><li>Amplify de coderende sequentie (CDS) van de genen van belang (M- en C-genen in ons geval) door PCR en kloon ze in geschikte entryvectoren (bijv. pENTR / D-TOPO-vector; zie tabel 1 voor vectoren die in dit experiment zijn gebruikt).</li>
	<li>Kweek de klonen op platen met antibiotica. Valideer klonen die zijn geselecteerd op de antibiotica door beperking van de...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay om de vorming van een ternair complex tussen twee monomeren van een MADS-box eiwit en een calciumsensoreiwit vast te stellen. Het protocol is aangepast van een rapport van Y. John Shyu et al. waar ze een op BiFC gebaseerde FRET-methode hebben ontwikkeld om ternair complex gevormd tussen Fos-Jun heterodimeren en NFAT of p65 te visualiseren met behulp van de gesensibiliseerde emissiemethode7. Eerder werd een fret-syste...

Eiwit-eiwit interacties (PPI's) vormen de basis van de goede werking van de eukaryote cellen door het reguleren van verschillende metabole en ontwikkelingsprocessen. Sommige PPI's zijn stabiel, terwijl andere van voorbijgaande aard zijn. De interacties kunnen worden gecategoriseerd op basis van het aantal en type leden in de interactie, zoals dimerisch, trimerisch, tetrameer homomerisch en heteromeer1. De identificatie en karakterisering van eiwitinteracties kan leiden tot een beter begrip van eiwitfuncties en regulerende netwerken.
Transcriptiefactoren zijn eiwitten die betrokken zijn bij regulerende functies. Ze reguleren de snelheid van transcriptie van hun stroomafwaartse genen door zich aan het DNA te binden. Soms is oligomerisatie of vorming van hogere-orde complexen door eiwitten een voorwaarde voor het uitvoeren van hun functies2. Plant MADS-box transcriptiefactoren zijn homeotische genen die verschillende processen reguleren, zoals bloemovergang, ontwikkeling van bloemorganen, bevruchting, zaadontwikkeling, senescentie en vegetatieve ontwikkeling. Het is bekend dat ze complexen van hogere orde vormen die binden aan het DNA3,4. Het bestuderen van PPI-netwerken tussen transcriptiefactoren en hun interactoren biedt inzicht in de complexiteit die ten grondslag ligt aan transcriptionele regulatie.
Voorbijgaande eiwitexpressie in Nicotiana benthamiana is een populaire benadering geweest om eiwitlokalisatie of eiwit-eiwitinteracties in vivotebestuderen 5. BiFC en FRET zijn methoden voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in vivo met behulp van fluorescerende reporter systemen6. Van een combinatie van deze twee technieken is aangetoond dat ze de interactie tussen drie eiwitten onthullen7. FRET wordt gemeten met behulp van acceptor photobleaching, sensitized emission en Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) techniek. FLIM-gebaseerde FRET-assay is naar voren gekomen als een hulpmiddel dat nauwkeurige kwantificering en spatiotemporale specificiteit biedt voor energieoverdrachtmetingen tussen twee moleculen op basis van hun fluorescentielevensduur8. FLIM meet de tijd dat een fluorofoor in een aangeslagen toestand blijft voordat een foton wordt uitgezonden en is beter dan technieken die alleen intensiteitsmetingen gebruiken9,10. Naast heterologe systemen zoals Nicotiana benthamiana en uienepidermale schillen, hebben recentere rapporten het gebruik van Arabidopsis-wortels en jonge rijstzaailingen, enz., Aangetoond voor in vivo analyse van eiwit-eiwitinteracties onder inheemse omstandigheden11,12.
Naast een geschikt expressiesysteem is ook de selectie van interacterende partners voor BiFC- en FRET-assays cruciaal voor het succes van dit experiment. De PPI onder partners die in biFC-configuratie worden gebruikt, moet worden gevalideerd met behulp van passende controles voordat ze als geconjugeerde partner in het FRET-experiment worden gebruikt13. BiFC maakt gebruik van de structurele complementatie van N- en C-terminale delen van het fluorescerende eiwit. Een veel voorkomende beperking in de meeste, zo niet alle fluorescerende eiwitten die in BiFC-assays worden gebruikt, is de zelfassemblage tussen de twee afgeleide niet-fluorescerende fragmenten, die bijdragen aan vals-positieve fluorescentie en de signaal-ruisverhouding (S / N) verminderen14. Recente ontwikkelingen, waaronder puntmutaties of positie van het splitsen van het fluorescerende eiwit, hebben geleid tot BiFC-paren met verhoogde intensiteit, hogere specificiteit, hoge S / N-verhouding15,16. Deze fluorescerende eiwitten kunnen ook worden gebruikt voor het uitvoeren van BiFC, afhankelijk van de geschiktheid van het experiment.
Traditioneel worden CFP en YFP gebruikt als donor- en acceptorpaar in FRET-experimenten17. YFP of m-Citrien bleken echter betere FRET-donoren te zijn (bij gebruik met RFP als acceptor) vanwege de hoge kwantumopbrengst (QY) tijdens de inheemse expressie van doeleiwitten in het Arabidopsis-wortelstelsel. De selectie van promotors (constitutief versus inheems/endogene) en fluorofoor spelen ook een cruciale rol bij het ontwerpen van een succesvol BiFC-FRET-FLIM-experiment. Het is essentieel om op te merken dat de efficiëntie van FRET-donoren en de geschiktheid van FRET-paren de neiging hebben om te veranderen met de verandering in de promotor en het biologische systeem dat wordt gebruikt voor expressie. De QY van de fluorofoor, die betrekking heeft op de helderheid, hangt af van de pH, temperatuur en het biologische systeem dat in gebruik is. We stellen voor dat deze criteria grondig worden overwogen voordat het fluorofoorpaar voor het FRET-experiment wordt gekozen. Het biologische systeem, promotors en de eiwitten die voor dit protocol werden gebruikt, werkten goed samen met CFP-YFP fluoroforen voor het BiFC FRET-FLIM-experiment.
In de huidige studie nemen we het kenmerk van FLIM op om de interactie tussen drie eiwitmoleculen te visualiseren met behulp van biFC-gebaseerde FRET. Bij deze techniek worden twee eiwitten gelabeld met gesplitst YFP-eiwit en het derde eiwit met CFP. Omdat we geïnteresseerd waren in het bestuderen van de interactie van een MADS-box eiwit (M) homodimeer met een Calcium sensor eiwit (C), werden deze eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten in pSITE-1CA en pSITE-3CA vectoren18. Twee van de interacterende partners, in deze test, werden getagd met N- en C-terminale delen van de YFP in pSPYNE-35S en pSPYCE-35S vectoren19, en hun interactie resulteert in de reconstitutie van de functionele YFP die fungeert als een FRET-acceptor voor de derde interagerende partner, die is getagd met CFP (optredend als FRET-donor) (Figuur 1 ). In dit specifieke geval is de PPI tussen twee M-monomeren en tussen M en C gevalideerd door BiFC in drie verschillende systemen uit te voeren, samen met het gist-twee-hybride systeem. Deze vectoren werden gemobiliseerd in Agrobacterium tumifaciens GV3101 stam door elektroporatie. De GV3101 stam heeft een ontwapend Ti plasmide pMP90 (pTiC58DT-DNA) met gentamicineresistentie20. Een p19 Agrobacterium stam werd toegevoegd samen met alle infiltraties om transgene silencing te voorkomen21. We raden aan dat de drie eiwitten ook in tegengestelde conformaties worden gebruikt om de tripartiete interacties te valideren.
In deze techniek hebben we FLIM gebruikt, waarbij eerst de fluorescentielevensduur van de donor (niet-uitgebloogde donorlevensduur) wordt gemeten in afwezigheid van een acceptor. Daarna wordt de levensduur gemeten in aanwezigheid van de acceptor (gebluste donorlevensduur). Dit verschil in donorfluorescentielevensduur wordt gebruikt om de FRET-efficiëntie te berekenen, die afhankelijk is van het aantal fotonen dat een vermindering van de fluorescentielevensduur vertoont. Hieronder wordt een gedetailleerd protocol genoemd om de vorming van een ternair complex tussen drie eiwitten te bepalen door de fluorescerend gelabelde eiwitten in Nicotiana benthamiana tijdelijk tot expressie te brengen en hun interactie te testen door BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Eiwit-eiwit interacties zijn een integraal onderdeel van alle biologische processen in de cellen, omdat ze een cruciale rol spelen bij het reguleren, onderhouden en wijzigen van cellulaire functies. Deze interacties zijn betrokken bij een breed scala aan verschijnselen zoals signaaltransductie, pathogene respons, cel-cel interacties, metabole en ontwikkelingsprocessen. In het geval van transcriptiefactoren kunnen deze interacties leiden tot oligomerisatie van subeenheden, sekwestering in specifieke subcellulaire contexten zoals de kern, cytoplasma, enz., Wat op zijn beurt een diepgaander effect kan hebben op de expressie van de stroomafwaartse genen. Hier demonstreren we een methodologie om in vivo tripartite interactie te visualiseren met behulp van Bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC) op basis van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) met fluorescentie lifetime imaging (FLIM). Twee van de eiwitten die voor deze demonstratie zijn geselecteerd, interageren als BiFC-partners en hun gereconstitueerde fluorescentieactiviteit wordt gebruikt om FRET-FLIM te testen met de derde partner. Vier tot vijf weken oude groeikamergekweekte Nicotiana benthamiana-planten zijn gebruikt als modelplantensysteem voor deze demonstratie.

Dit protocol vertegenwoordigt een geoptimaliseerde methode om in vivo tripartiete eiwit-eiwitinteracties in planten te bestuderen. Het basisprincipe van het protocol is om twee fluorescentie-gelabelde eiwitinteractietechnieken, d.w.z. BiFC en FRET, te combineren om een test te maken om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te meten. Hier hebben we FLIM gebruikt om de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner te meten in de aan- en afwezigheid van de FRET-acceptor. Een vermindering va...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Hier presenteren we een methode om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te visualiseren met behulp van fluorescerende gelabelde eiwitten door biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteractiecomplexen in vivo.

Bepaling van de tripartiete interactie tussen twee monomeren van een MADS-box transcriptiefactor en een calciumsensoreiwit door BiFC-FRET-FLIM-assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

De studie van eiwit-eiwit interacties geeft inzicht in de regulatie van vele biologische processen. Hier demonstreren we een procedure beschreven in eerste instantie door Y John schoen en co. Workers in 2007, waar de auteurs BiFC in combinatie met FRET hebben gebruikt om de tripartiete interactie tussen drie eiwitmoleculen te valideren.We hebben echter fluorescentielevensduurmetingen in deze procedure opgenomen om FRET-metingen te onderbouwen. Om een tripartiete interactie aan te tonen, hebben we een eiwit gekozen waarvan bekend is dat het homodimeriseert. Bovendien is het ook intern gevalideerd om te interageren met een calciumsensor van eiwit die in dit protocol C-eiwit wordt genoemd.De MNC-eiwitten interageren in het cytoplasma. Bij deze techniek worden twee eiwitten gelabeld met gesplitste YFP-eiwitten. Hun interactie resulteert in de teruggave van functionele YFP die fungeren als een FRET-acceptor aan de derde interacterende partner, die is getagd met CFP die optreedt als EEN FRET-donor.Begin met de amplificatie van de coderende sequenties van de genen van belang die in ons geval M- en C-genen zijn door PCR en kloon ze in geschikte invoervectoren. Valideer klonen die zijn geselecteerd op de antibiotica die platen bevatten door restrictievertering en DNA-sequencing. Mobiliseer de gereconstitueerde CDS'van invoerklonen naar de doelvectoren.Alle vectoren die in dit experiment zijn gebruikt, staan in tabel één. Transformeer ten slotte agrobacterium GV3101-cellen met de bestemmingsvectoren door elektroporatie. Hier kweken we Nicotiana Benthamiana planten die nog steeds vier tot zes in gecontroleerde omstandigheden in een kweekkamer staan.Bereid het grondmengsel door soilrite, cocopeat en compost te mengen in een verhouding van 2:1:1. Verspreid een een centimeter dikke laag van deze mix in een plastic bak om het grondbed te maken en te verzadigen met een beetje water. Strooi ongeveer 200 zaden over de grond en breng het over in een grotere bak die ongeveer een centimeter stilstaand water is.Bedek dit bakje met plasticfolie om een vochtkamer te creëren. Breng deze tray over naar een kweekkamer op 23 graden Celsius met een lichte en acht uur donkere cyclus van 16 uur. Breng na twee weken de jonge zaailingen over naar kleine potten van drie tot vier inch met waterverzadigde grondmix.Plaats deze potten in een plastic bakje en breng ze nog vier weken over naar de kweekkamer. Voor agro-infiltratie moeten de bacteriestammen vers worden gesubcultureerd en gemengd samen met de P19-stam van agrobacterium in geschikte verhoudingen. Start deze procedure door GV3101 agrobacterium stammen die BiFC en FRET constructies bevatten uit streepplaten in 10 ml te enten.op de bouillon die geschikte antibiotica bevat. Start daarnaast ook een cultuur van P19-stam van agrobacteriën, die wordt toegevoegd om transgene silencing te voorkomen. Bedek de kolf met aluminiumfolie en bewaar ze in een incubator shaker, zet hem 28 graden Celsius bij 170 RPM gedurende 16 uur.Na de nachtelijke groei wordt 1 ml. van deze culturen overgebracht naar een wegwerpcubit om de optische dichtheid op 600 nanometer te meten met behulp van een spectrofotometer. Meng de culturen van geschikte BiFC- en FRET-partnerbevattende stammen zodat de uiteindelijke OD 0,5 is en die van P19 0,3 in een totaal volume van 2 ml.Om deze verhoudingen te bereiken volgen we voor deze berekeningen de formule op het scherm. Centrifugeer de gemengde agrobacteriumculturen bij 3000G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant voorzichtig weg. Suspensie van de pellets in een 2 ml.infiltratiebuffer. Mogelijk moet u een vortexmixer gebruiken om de cellen opnieuw volledig in een homogene celsuspensie te suspensie te suspensie. Incubeer hierna de buizen bij kamertemperatuur in het donker gedurende drie uur.Label ondertussen elke plantenpot voor het constructmengsel waarmee het zal worden geïnfiltreerd. Vul een naaldloze spuit van 1 ml. met de agrobacteriële mix.Druk de punt van de spuit voorzichtig maar stevig tegen de abaxiale kant van een volledig geëxpandeerd blad terwijl u het blad vanaf de andere kant ondersteunt. Duw voorzichtig op de zuiger totdat de oplossing zich vult in het bladoppervlak dat overeenkomt met twee tot drie keer dat van de punt van de spuit. Infiltreer het bacteriële mengsel op maximaal vier plekken op één blad en herhaal deze procedure voor drie tot vier bladeren voor één soort infiltratie.Neem ook ten minste twee planten per constructie op voor infiltratie. Vergeet niet om je handen af te vegen met 70% alcohol of je handschoenen te vervangen om kruisbesmetting te voorkomen. Breng alle potten over naar een bak en incubeer in de groeikamer in dezelfde groeiconditie.Controleer een klein deel van het agro-geïnfiltreerde blad met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Wanneer de fluorescentie van zowel YFP als CFP detecteerbaar zijn in cellen, gaat u verder met de confocale microscoop voor BiFC FRET-FLIM-test. In ons geval werd deze analyse drie dagen na agro-infiltratie uitgevoerd.Nu de planten klaar zijn om onder een microscoop te worden gevisualiseerd, snijdt u vierkante bladmonsters van vijf tot 8 mm. weg van de spuitpunt wond en monteert u ze op gedestilleerd water. Leg er een schone afdekplaat overheen en sluit af.Visualiseer deze monsters in een confocale laserscanmicroscoop. In deze procedure is de basis voor het bepalen en kwantificeren van de interactie tussen twee eiwitten de vermindering van de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner bij zijn interactie met de acceptor, die wordt gebruikt om de efficiëntie van FRET te berekenen. De complexiteit in het geval van tripartiete interactie neemt verder toe omdat FRET-acceptor in dit geval geen enkel molecuul is, maar een gesplitst YFP BiFC-paar, dat eerst in vivo moet worden gereconstitueerd om een functionele FRET-acceptorfluoofoor te worden.Om FRET-FLIM uit te voeren, moeten we de fluorescentielevensduur van de donormoleculen bepalen, eerst alleen en vervolgens in aanwezigheid van een FRET-partner. Open de FLIM-toepassing in de confocale laserscanmicroscoop, start de console en gebruik de patroonherkenning fotonentelling om de fluorescentielevensduur te meten. Selecteer de standaard meetmodus voor het tellen van fotonen.We nemen twee soorten agro-geïnfiltreerde planten. Een die het CCFP-gen heeft en de andere die CCFP samen met MYFP heeft omdat de interactie van M-eiwit al is gevalideerd met het C-eiwit met behulp van BiFC en Y2H, we verwachten een goede FRET-efficiëntie met dit interagerende paar. Nu scannen we eerst het CCFP agro-geïnfiltreerde blad en zoeken we naar een cel met goede CFP-fluorescentie.De microscoopinstellingen worden op het scherm weergegeven. Het monster wordt verlicht met voldoende laservermogen om ongeveer 0,1 fotonen per puls te bereiken. Voor monsters met variabele fluorescentie-intensiteit leggen we 50 frames vast om voldoende fotonen te verzamelen die nodig zijn voor de levensduurmeting.Omdat bekend is dat CFP twee fluorescentielevensduur vertoont vanwege de bevestigingsaanpassing, voeden we de gegevens met behulp van een exponentieel reconvolutiemodel terwijl de waarde van N gelijk blijft aan twee. Bij deze instellingen zijn de twee levens zichtbaar op één en 3,2 nanoseconden. We zullen de hogere levensduur gebruiken voor alle volgende berekeningen.We zijn nu klaar om FRET te meten tussen CCFP en MYFP. Laten we hiervoor het bladmonster van de agro-geïnfiltreerde plant met CCFP en MYFP gebruiken. We zoeken naar een cel die zowel CCFP als MYFP tot expressie brengt en hun respectieve emissiepatronen bevestigt door ze op te winden met behulp van volledige 40 nanometer pulslaser en 514 nanometer witlichtlaser.Daarna schakelen we over naar de FLIM-console om de levensduur van CFP te meten met dezelfde instellingen die we eerder gebruikten voor het meten van de levensduur van CCFP. Maar deze keer drukt de cel ook MYFP uit die mogelijk kan interageren met CCFP en een verkorting van de levensduur van CCFP kan veroorzaken. Zoals we de grafiek hebben gelezen die is verkregen met behulp van het N exponentiële reconvolutiemodel met N gelijk aan twee, is er in feite een afname van de GVB-levensduur van 3,2 tot 2,6 nanoseconden.We starten nu de FRET-console in de software en berekenen de FRET-efficiëntie door handmatig een onbetwistbare levensduur in te voeren in de vergelijking in de software en de waargenomen FRET-efficiëntie is 56%Laten we nu naar de laatste stap gaan, dat is om de interactie tussen drie partners te visualiseren. Hiervoor nemen we het bladmonster van een plant die mede geïnfiltreerd was met CCFP en MYFPN met MYFPC. We scannen de bladplant op een cel die zowel CFP- als gereconstitueerde YFP-fluorescentie vertoont die voortkomt uit interactie tussen twee M-eiwitten.We gebruiken dezelfde laser- en emissiegolflengte als eerder. Vervolgens schakelen we de 514 nanometer laser uit en gaan we naar de FLIM console. Als het MYFP-dimeer interageert met CCFP.We zouden een vermindering van de levensduur van CCFP moeten zien, zoals waargenomen tijdens de interactie met MYFP. Als de CCFP echter niet interageert met het MYFP-dimeer, moet de fluorescentielevensduur op 3,2 nanoseconden blijven. Met behulp van de vergelijkbare instellingen zoals hierboven vermeld, meten we de GVB-levensduur in aanwezigheid van gereconstitueerde YFP.We passen de grafiek met behulp van het N exponentiële reconvolutiemodel met een gelijk aan twee en gaan naar de FRET-console. En ja, er is een daling van de levensduur van het GVB van 3,2 naar 2,3 nanoseconden. Wij berekenen de FRET efficiëntie zoals hierboven beschreven.De berekende FRET-efficiëntie is 55%Hier hebben we FLIM gebruikt om de fluorescentielevensduur van de FRET-donorpartner te meten in de aan- en afwezigheid van de FRET-acceptor. Een vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor werd verwacht als er een positieve interactie tussen de twee eiwitten was. Bij positieve controle zijn dat CCFP en MYFP.We zien een vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor van 3,3 tot 2,5 nanoseconden en de FRET-efficiëntie was 56%Een vergelijkbare oefening met gereconstitueerde YFP resulteerde in de interactie tussen twee amonomeren en C-eiwitten resulteerde ook in een positieve FRET-interactie die leidde tot de vermindering van de fluorescentielevensduur van de donor tot 2,6 nanoseconden. De berekende FRET-efficiëntie was in dit geval ongeveer 55%. De vermindering van de fluorescentielevensduur van de FRET-donor levert een sterk bewijs voor een tripartiete interactie tussen deze eiwitten.Het hier beschreven protocol is een krachtig hulpmiddel om tripartiete eiwit-eiwitinteracties in levende cellen te bepalen. Deze procedure kan ook helpen bij het bepalen van de intracellulaire lokalisatie van de resulterende complexen, wat belangrijk is bij het ontcijferen van de functie en fysiologische betekenis van elk eiwitcomplex. Kortom, biFC gebaseerde FRET-FLIM-test biedt de mogelijkheid om belangrijke aspecten van tripartiete eiwitinteracties te bestuderen en te karakteriseren, wat nuttig kan zijn in eiwit-eiwitinteractiestudies in zowel dierlijke als plantaardige systemen.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...