Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC remercient sincèrement la University Grants Commission (UGC), uGC-BSR, DBT-INSPIRE et le Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) pour leurs bourses de recherche. Nous remercions le Département de biotechnologie (DBT), le Gouvernement de l’Inde, le Département des sciences et de la technologie (DST-FIST) et le Gouvernement indien pour leur soutien financier.

1. Clonage de gènes dans des vecteurs d’entrée et de destination (Figure2)
<ol><li>Amplifier la séquence codante (CDS) des gènes d’intérêt (gènes M et C dans notre cas) par PCR et les cloner dans des vecteurs d’entrée appropriés (par exemple, vecteur pENTR/D-TOPO; voir le tableau 1 pour les vecteurs utilisés dans cette expérience).</li>
	<li>Cultivez les clones sur des plaques contenant des antibiotiques. Valider ...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

Le présent protocole démontre l’utilisation du test FRET-FLIM à base de BiFC pour déterminer la formation d’un complexe ternaire entre deux monomères d’une protéine MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium. Le protocole est adapté d’un rapport de Y. John Shyu et al. où ils ont développé une méthode FRET basée sur BiFC pour visualiser le complexe ternaire formé entre les hétérodimères de Fos-Jun et NFAT ou p65 en utilisant la méthode d’émission sensibilisée7....

Les interactions protéine-protéine (IPP) constituent la base du bon fonctionnement des cellules eucaryotes en régulant divers processus métaboliques et développementaux. Certains IPP sont stables, tandis que d’autres sont de nature transitoire. Les interactions peuvent être classées en fonction du nombre et du type de membres de l’interaction tels que dimérique, trimérique, tétramérique homomérique et hétéromère1. L’identification et la caractérisation des interactions protéiques peuvent mener à une meilleure compréhension des fonctions protéiques et des réseaux de régulation.
Les facteurs de transcription sont des protéines impliquées dans les fonctions régulatrices. Ils régulent le taux de transcription de leurs gènes en aval en se liant à l’ADN. Parfois, l’oligomérisation ou la formation de complexes d’ordre supérieur par les protéines est une condition préalable à l’accomplissement de leurs fonctions2. Les facteurs de transcription mads-box des plantes sont des gènes homéotiques qui régulent divers processus tels que la transition florale, le développement des organes floraux, la fécondation, le développement des graines, la sénescence et le développement végétatif. Ils sont connus pour former des complexes d’ordre supérieur qui se lient à l’ADN3,4. L’étude des réseaux IPP entre les facteurs de transcription et leurs interacteurs fournit des informations sur la complexité sous-jacente à la régulation transcriptionnelle.
L’expression protéique transitoire chez Nicotiana benthamiana a été une approche populaire pour étudier la localisation des protéines ou les interactions protéine-protéine in vivo5. BiFC et FRET sont des méthodes permettant d’étudier les interactions protéine-protéine in vivo à l’aide de systèmes rapporteurs fluorescents6. Il a été démontré qu’une combinaison de ces deux techniques révèle l’interaction entre trois protéines7. Fret est mesuré à l’aide de la technique de photoblanchiment accepteur, d’émission sensibilisée et d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM). Le test FRET basé sur FLIM est apparu comme un outil qui fournit une quantification précise et une spécificité spatio-temporelle aux mesures de transfert d’énergie entre deux molécules en fonction de leur durée de vie en fluorescence8. FLIM mesure le temps pendant lequel un fluorophore reste dans un état excité avant d’émettre un photon et est meilleur que les techniques qui utilisent des mesures d’intensité seules9,10. Outre les systèmes hétérologues tels que Nicotiana benthamiana et les pelures épidermiques d’oignons, des rapports plus récents ont démontré l’utilisation de racines d’Arabidopsis et de jeunes plants de riz, etc., pour l’analyse in vivo des interactions protéine-protéine dans des conditions natives11,12.
Outre un système d’expression approprié, la sélection de partenaires en interaction pour les tests BiFC et FRET est également cruciale pour le succès de cette expérience. L’IPP parmi les partenaires utilisés dans la configuration BiFC doit être validé à l’aide de contrôles appropriés avant leur utilisation en tant que partenaire conjugué dans l’expérience FRET13. BiFC utilise la complémentarité structurelle des parties N- et C-terminales de la protéine fluorescente. Une limitation commune dans la plupart, sinon la totalité, des protéines fluorescentes utilisées dans les tests BiFC a été l’auto-assemblage entre les deux fragments non fluorescents dérivés, contribuant à la fluorescence faussement positive et diminuant le rapport signal/bruit (S / N)14. Des développements récents, y compris des mutations ponctuelles ou la position de division de la protéine fluorescente, ont donné lieu à des paires BiFC avec une intensité accrue, une spécificité plus élevée, un rapport S / N élevé15,16. Ces protéines fluorescentes peuvent également être utilisées pour réaliser BiFC en fonction de la pertinence de l’expérience.
Traditionnellement, la CFP et la YFP ont été utilisées comme paire donneur et accepteur dans les expériences FRET17. Cependant, YFP ou m-Citrine se sont avérés être de meilleurs donneurs de FRET (lorsqu’ils sont utilisés avec RFP comme accepteur) en raison du rendement quantique élevé (QY) lors de l’expression native des protéines cibles dans le système racinaire d’Arabidopsis. La sélection des promoteurs (constitutifs versus natifs/endogènes) et du fluorophore joue également un rôle crucial dans la conception d’une expérience BiFC-FRET-FLIM réussie. Il est essentiel de noter que l’efficacité des donneurs de FRET et l’adéquation des paires de FRET ont tendance à changer avec le changement du promoteur et du système biologique utilisé pour l’expression. Le QY du fluorophore, qui se rapporte à sa luminosité, dépend du pH, de la température et du système biologique utilisé. Nous suggérons que ces critères soient soigneusement pris en compte avant de choisir la paire de fluorophores pour l’expérience FRET. Le système biologique, les promoteurs et les protéines utilisées pour ce protocole ont bien fonctionné avec les fluorophores CFP-YFP pour l’expérience BiFC FRET-FLIM.
Dans la présente étude, nous intégrons la fonctionnalité de FLIM pour visualiser l’interaction entre trois molécules de protéines à l’aide de FRET à base de BiFC. Dans cette technique, deux protéines sont marquées avec la protéine YFP fractionnée et la troisième protéine avec la CFP. Comme nous étions intéressés par l’étude de l’interaction d’un homodimère de protéine MADS-box (M) avec une protéine de capteur de calcium (C), ces protéines ont été marquées avec des protéines fluorescentes dans les vecteurs pSITE-1CA et pSITE-3CA18. Deux des partenaires en interaction, dans ce test, ont été marqués avec des parties terminales N et C du YFP dans les vecteurs pSPYNE-35S et pSPYCE-35S19, et leur interaction entraîne la reconstitution du YFP fonctionnel qui agit comme un accepteur FRET au troisième partenaire en interaction, qui est marqué avec CFP (agissant en tant que donneur FRET) (Figure 1 ). Dans ce cas particulier, l’IPP entre deux monomères M et entre M et C a été validé en effectuant BiFC dans trois systèmes différents avec le système levure-deux-hybrides. Ces vecteurs ont été mobilisés en souche Agrobacterium tumifaciens GV3101 par électroporation. La souche GV3101 possède un plasmide Ti désarmé pMP90 (pTiC58DT-ADN) avec une résistance à la gentamicine20. Une souche p19 Agrobacterium a été ajoutée avec toutes les infiltrations pour empêcher le silence transgénique21. Nous recommandons que les trois protéines soient également utilisées dans des conformations opposées pour valider les interactions tripartites.
Dans cette technique, nous avons utilisé FLIM, où d’abord, la durée de vie de fluorescence du donneur (durée de vie du donneur non éteint) est mesurée en l’absence d’accepteur. Après cela, sa durée de vie est mesurée en présence de l’accepteur (durée de vie du donneur trempé). Cette différence dans la durée de vie de la fluorescence du donneur est utilisée pour calculer l’efficacité FRET, qui dépend du nombre de photons présentant une réduction de la durée de vie de la fluorescence. Mentionné ci-dessous est un protocole détaillé pour déterminer la formation d’un complexe ternaire entre trois protéines quelconques en exprimant transitoirement les protéines marquées par fluorescence dans Nicotiana benthamiana et en testant leur interaction par BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Les interactions protéine-protéine font partie intégrante de tous les processus biologiques dans les cellules car elles jouent un rôle crucial dans la régulation, le maintien et la modification des fonctions cellulaires. Ces interactions sont impliquées dans un large éventail de phénomènes tels que la transduction du signal, la réponse des agents pathogènes, les interactions cellule-cellule, les processus métaboliques et de développement. Dans le cas des facteurs de transcription, ces interactions peuvent conduire à l’oligomérisation des sous-unités, à la séquestration dans des contextes subcellulaires spécifiques tels que le noyau, le cytoplasme, etc., ce qui, à son tour, pourrait avoir un effet plus profond sur l’expression des gènes en aval. Ici, nous démontrons une méthodologie pour visualiser l’interaction tripartite in vivo en utilisant le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) basé sur la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) impliquant l’imagerie à vie de fluorescence (FLIM). Deux des protéines sélectionnées pour cette démonstration interagissent en tant que partenaires BiFC, et leur activité de fluorescence reconstituée est utilisée pour tester FRET-FLIM avec le troisième partenaire. Des plantes Nicotiana benthamiana cultivées en chambre de croissance âgées de quatre à cinq semaines ont été utilisées comme système de plantes modèles pour cette démonstration.

Ce protocole représente une méthode optimisée pour étudier in vivo les interactions tripartites protéine-protéine chez les plantes. Le principe de base du protocole est de combiner deux techniques d’interaction protéique marquées par fluorescence, à savoir BiFC et FRET, pour créer un test permettant de mesurer la formation de complexes ternaires entre trois partenaires protéiques. Ici, nous avons utilisé FLIM pour mesurer la durée de vie de fluorescence du partenaire donneur FRET en présence et e...

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Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Nous présentons ici une méthode pour visualiser la formation de complexes ternaires entre trois partenaires protéiques à l’aide de protéines marquées par fluorescence par le test FRET-FLIM basé sur BiFC. Cette méthode est précieuse pour étudier les complexes d’interaction protéine-protéine in vivo.

Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

L’étude des interactions protéine-protéine permet de comprendre la régulation de nombreux processus biologiques. Ici, nous démontrons une procédure décrite initialement par Y John shoe and co. Workers en 2007, où les auteurs ont utilisé BiFC en combinaison avec FRET pour valider l’interaction tripartite entre trois molécules de protéines.Cependant, nous avons inclus des mesures de la durée de vie de la fluorescence dans cette procédure pour étayer les mesures FRET. Pour démontrer une interaction tripartite, nous avons choisi une protéine, qui est connue pour homodimériser. En outre, il a également été validé en interne pour interagir avec un capteur de calcium de protéine appelée protéine C dans ce protocole.Les protéines MNC interagissent dans le cytoplasme. Dans cette technique, deux protéines sont marquées avec des protéines YFP fractionnées. Leur interaction se traduit par la restitution de YFP fonctionnels qui agissent comme un accepteur FRET au troisième partenaire en interaction, qui est étiqueté avec CFP agissant en tant que donneur FRET.Commencez par l’amplification des séquences codantes des gènes d’intérêt qui sont des gènes M et C dans notre cas par PCR et clonez-les dans des vecteurs d’entrée appropriés. Valider les clones sélectionnés sur les plaques contenant des antibiotiques par digestion de restriction et séquençage de l’ADN. Mobilisez les CDS reconstitués des clones d’entrée vers les vecteurs de destination.Tous les vecteurs utilisés dans cette expérience sont répertoriés dans le premier tableau. Enfin, transformez les cellules de l’agrobactérie GV3101 avec les vecteurs de destination par électroporation. Ici, nous cultivons des plantes Nicotiana Benthamiana encore quatre à six étapes de départ dans des conditions contrôlées dans une chambre de culture.Préparez le mélange de sol en mélangeant de la soilrite, de la tourbe de coco et du compost dans un rapport de 2:1:1. Étalez une couche d’un pouce d’épaisseur de ce mélange dans un plateau en plastique pour faire le lit de sol et le saturer avec un peu d’eau. Saupoudrez environ 200 graines sur le sol et transférez-les dans un plateau plus grand qu’environ un centimètre d’eau stagnante.Couvrez ce plateau avec une pellicule de plastique pour créer une chambre à humidité. Transférez ce plateau dans une chambre de culture fixée à 23 degrés centigrades avec un cycle de lumière de 16 heures et un cycle sombre de huit heures. Après deux semaines, transférez les jeunes plants dans de petits pots de trois à quatre pouces contenant un mélange de sol saturé d’eau.Placez ces pots dans un plateau en plastique et transférez-les dans la chambre de culture pendant quatre semaines supplémentaires. Pour l’agroinfiltration, les souches bactériennes doivent être fraîchement sous-cultivées et mélangées avec la souche P19 d’agrobactérie dans des proportions appropriées. Commencez cette procédure en inoculant des souches d’agrobactéries GV3101 contenant des constructions BiFC et FRET à partir de plaques de stries dans 10 ml.au bouillon contenant des antibiotiques appropriés. Parallèlement, initier également une culture de la souche P19 d’agrobactéries, qui est ajoutée pour empêcher le silence transgénique. Couvrez la fiole avec du papier d’aluminium et conservez-la dans un agitateur d’incubateur, réglez-la à 28 degrés centigrades à 170 tr / min pendant 16 heures.Après la croissance pendant la nuit, transférer 1 ml de ces cultures dans une coudée jetable pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Mélanger les cultures de BiFC et fret appropriés contenant des souches contenant de sorte que la DO finale soit de 0,5 et celle de P19 soit de 0,3 dans un volume total de 2 ml.Pour atteindre ces ratios, nous suivons la formule affichée à l’écran pour ces calculs. Centrifuger les cultures d’agrobactéries mélangées à 3000G pendant cinq minutes à température ambiante et jeter soigneusement le surnageant. Suspendre les granulés dans un 2 ml.tampon d’infiltration. Vous devrez peut-être utiliser un mélangeur vortex pour suspendre complètement les cellules dans une suspension cellulaire homogène. Après cela, incubez les tubes à température ambiante dans l’obscurité pendant trois heures.Pendant ce temps, étiquetez chaque pot de plante pour le mélange de construction avec lequel il va être infiltré. Remplissez une seringue sans aiguille de 1 ml avec le mélange agrobactérien.Appuyez doucement mais fermement sur l’extrémité de la seringue sur le côté abaxial d’une feuille complètement dilatée tout en soutenant la feuille de l’autre côté. Poussez doucement le piston jusqu’à ce que la solution se remplisse dans la surface foliaire équivalente à deux à trois fois celle de la pointe de la seringue. Infiltrez le mélange bactérien jusqu’à quatre endroits sur une feuille et répétez cette procédure pendant trois à quatre feuilles pour un type d’infiltration.Incluez également au moins deux plantes par construction pour l’infiltration. N’oubliez pas de vous essuyer les mains avec 70% d’alcool ou de changer vos gants pour éviter toute contamination croisée. Transférer tous les pots sur un plateau et incuber dans la chambre de croissance dans les mêmes conditions de croissance.Vérifiez une petite partie de la feuille agroinfiltrée à l’aide d’un microscope à fluorescence. Lorsque la fluorescence du YFP et du CFP est détectable dans les cellules, passez au microscope confocal pour le test BiFC FRET-FLIM. Dans notre cas, cette analyse a été réalisée trois jours après l’agroinfiltration.Maintenant que les plantes sont prêtes à être visualisées au microscope, coupez des échantillons de feuilles carrées de cinq à 8 mm de la pointe de la seringue et montez-les sur de l’eau distillée. Placez un couvercle propre sur celui-ci et scellez-le.Visualisez ces échantillons dans un microscope confocal à balayage laser. Dans cette procédure, la base de la détermination et de la quantification de l’interaction entre deux protéines est la réduction de la durée de vie de fluorescence du partenaire donneur FRET lors de son interaction avec l’accepteur, qui est utilisée pour calculer l’efficacité de FRET. La complexité dans le cas d’une interaction tripartite augmente encore parce que l’accepteur FRET dans ce cas n’est pas une molécule unique, mais une paire YFP BiFC divisée, qui devrait d’abord être reconstituée in vivo pour devenir un fluorophore accepteur FRET fonctionnel.Pour réaliser FRET-FLIM, nous devons déterminer la durée de vie de fluorescence des molécules donneuses, d’abord seul, puis en présence d’un partenaire FRET. Ouvrez l’application FLIM dans le microscope à balayage laser confocal, démarrez la console et utilisez le comptage de photons de reconnaissance de formes pour mesurer la durée de vie de la fluorescence. Sélectionnez le mode de mesure standard de comptage de tous les photons.Nous prendrons deux types de plantes agroinfiltrées. L’un qui a le gène CCFP et l’autre qui a CCFP avec MYFP parce que l’interaction de la protéine M a déjà été validée avec la protéine C en utilisant BiFC et Y2H, nous nous attendons à une bonne efficacité FRET avec cette paire en interaction. Maintenant, nous scannons d’abord la feuille agroinfiltrée CCFP et recherchons une cellule montrant une bonne fluorescence CFP.Les paramètres du microscope sont affichés à l’écran. L’échantillon est éclairé à une puissance laser suffisante pour atteindre environ 0,1 photon par impulsion. Pour les échantillons à intensité de fluorescence variable, nous capturerons 50 images pour collecter les photons adéquats nécessaires à la mesure de la durée de vie.Comme la CFP est connue pour présenter deux durées de vie de fluorescence en raison de son adaptation confirmative, nous alimentons les données à l’aide d’un modèle de reconvolution exponentielle tout en maintenant la valeur de N égale à deux. À ces réglages, les deux durées de vie sont visibles à une et 3,2 nanosecondes. Nous utiliserons la durée de vie la plus élevée pour tous les calculs ultérieurs.Nous sommes maintenant prêts à mesurer le FRET entre CCFP et MYFP. Pour cela, utilisons l’échantillon de feuilles de la plante agroinfiltrée avec CCFP et MYFP. Nous recherchons une cellule qui exprime à la fois CCFP et MYFP et confirmons leurs modèles d’émission respectifs en les excitant à l’aide d’un laser à impulsions de 40 nanomètres et d’un laser à lumière blanche de 514 nanomètres.Après cela, nous passons à la console FLIM pour mesurer la durée de vie de CFP en utilisant les mêmes paramètres que nous avons utilisés précédemment pour mesurer la durée de vie de CCFP. Mais cette fois, la cellule exprime également myFP qui peut potentiellement interagir avec CCFP et provoquer une réduction de la durée de vie de CCFP. Comme nous avons lu le graphique obtenu en utilisant le modèle de reconvolution exponentielle N avec N égal à deux, il y a en fait une diminution de la durée de vie CFP de 3,2 à 2,6 nanosecondes.Nous démarrons maintenant la console FRET dans le logiciel et calculons l’efficacité FRET en entrant manuellement une durée de vie incontestable dans l’équation fournie dans le logiciel et l’efficacité FRET observée est de 56%Passons maintenant à l’étape finale, c’est-à-dire visualiser l’interaction entre trois partenaires. Pour cela, nous prélevons l’échantillon de feuilles d’une plante qui a été co-infiltrée avec CCFP et MYFPN avec MYFPC. Nous scannons la plante foliaire à la recherche d’une cellule qui montre à la fois la CFP et la fluorescence YFP reconstituée émanant de l’interaction entre deux protéines M.Nous utilisons le même laser et la même longueur d’onde d’émission que ceux utilisés précédemment. Par la suite, nous éteignons le laser de 514 nanomètres et passons à la console FLIM. Si le dimère MYFP interagit avec CCFP.Nous devrions voir une réduction de la durée de vie du CCFP telle qu’observée lors de son interaction avec le MYFP. Cependant, si le CCFP n’interagit pas avec le dimère MYFP, sa durée de vie en fluorescence devrait rester observée à 3,2 nanosecondes. En utilisant les paramètres similaires mentionnés ci-dessus, nous mesurons la durée de vie de la PCP en présence de YFP reconstitué.Nous ajustons le graphique à l’aide du modèle de reconvolution exponentielle N avec un égal à deux et passons à la console FRET. Et oui, il y a une baisse de la durée de vie de la PCP de 3,2 à 2,3 nanosecondes. Nous calculons l’efficacité FRET comme décrit ci-dessus.L’efficacité FRET calculée est de 55% Ici, nous avons utilisé FLIM pour mesurer la durée de vie de fluorescence du partenaire donneur FRET en présence et en l’absence de l’accepteur FRET. Une réduction de la durée de vie de fluorescence du donneur était attendue s’il y avait une interaction positive entre les deux protéines. En cas de contrôle positif, il s’agit du CCFP et du MYFP.Nous observons une réduction de la durée de vie de fluorescence du donneur de 3,3 à 2,5 nanosecondes et l’efficacité FRET était de 56%Un exercice similaire avec YFP reconstitué résultant de l’interaction entre deux amonomères et les protéines C a également entraîné une interaction FRET positive conduisant à la réduction de la durée de vie de fluorescence du donneur à 2,6 nanosecondes. L’efficacité FRET calculée était d’environ 55% dans ce cas. La réduction de la durée de vie de la fluorescence du donneur FRET fournit une preuve solide d’une interaction tripartite entre ces protéines.Le protocole décrit ici est un outil puissant pour déterminer les interactions tripartites protéine-protéine dans les cellules vivantes. Cette procédure peut également aider à déterminer la localisation intracellulaire des complexes résultants, ce qui est important pour déchiffrer la fonction et la signification physiologique de tout complexe protéique. En conclusion, le test FRET-FLIM basé sur BiFC offre l’occasion d’étudier et de caractériser des aspects importants des interactions protéiques tripartites, ce qui peut être utile dans les études d’interaction protéine-protéine dans les systèmes animal et végétal.

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