Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC מודים בכנות לוועדת המענקים של האוניברסיטה (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE והמועצה למחקר מדעי ותעשייתי (CSIR) על מלגות המחקר שלהם. למרבה המזל אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממשלת הודו, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST-FIST), ממשלת הודו לתמיכה כספית.

1. שיבוט גנים בווקטורים של כניסה ויעד (איור 2)
<ol><li>להגביר את רצף הקידוד (CDS) של הגנים מעניינים (גנים M ו- C במקרה שלנו) על ידי PCR ולשכפל אותם בווקטורים כניסה מתאימים (למשל, וקטור pENTR / D-TOPO; ראה טבלה 1 עבור וקטורים המשמשים בניסוי זה).</li>
	<li>לגדל את השיב...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת FRET-FLIM מבוססת BiFC כדי לברר את היווצרותו של קומפלקס טרנרי בין שני מונומרים של חלבון תיבת MADS וחלבון חיישן סידן. הפרוטוקול מותאם מדו"ח של Y. John Shyu et al. שבו הם פיתחו שיטת FRET מבוססת BiFC כדי לדמיין קומפלקס טרנרי שנוצר בין הטרודימרים פוס-יוני ו- NFAT או p65 בשיטת הפלי...

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) מהווים את הבסיס לתפקוד תקין של התאים האוקריוטים על ידי ויסות תהליכים מטבוליים והתפתחותיים שונים. חלק מה- PPIs יציבים, בעוד שאחרים ארעיים בטבע. האינטראקציות עשויות להיות מסווגות בהתבסס על מספר וסוג החברים באינטראקציה כגון דימריק, טרימרי, הומומרי טטרמרי והטרומרי1. זיהוי ואפיון של אינטראקציות חלבון עשוי להוביל להבנה טובה יותר של פונקציות חלבון ורשתות רגולטוריות.
גורמי שעתוק הם חלבונים המעורבים בתפקודים רגולטוריים. הם מווסתים את קצב התמלול של הגנים במורד הזרם שלהם על ידי קשירה לדנ"א. לפעמים אוליגומריזציה או היווצרות של מתחמים מסדר גבוה יותר על ידי חלבונים הוא תנאי מוקדם לביצוע הפונקציות שלהם2. גורמי שעתוק של קופסת MADS הם גנים הומיאוטיים המווסתים תהליכים שונים כגון מעבר פרחוני, פיתוח איברים פרחוניים, הפריה, התפתחות זרעים, סנסנס והתפתחות וגטטיבית. הם ידועים ליצור מתחמים מסדר גבוה יותר אשר נקשרים ל- DNA3,4. לימוד רשתות PPI בין גורמי תמלול והאינטראקטיביות שלהם מספק תובנות לגבי המורכבות שבבסיס רגולציית התמלול.
ביטוי חלבון חולף בניקוטיאנה בנתמיאנה היה גישה פופולרית לחקר לוקליזציה של חלבונים או אינטראקציות חלבון-חלבון ב- vivo5. BiFC ו- FRET הן שיטות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ב- vivo באמצעות מערכות עיתונאי פלואורסצנטיות6. שילוב של שתי טכניקות אלה הוכח לחשוף את האינטראקציה בין שלושה חלבונים7. FRET נמדד באמצעות הדמיה מקבלת, פליטה רגישה וטכניקת הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטיות (FLIM). בדיקת FRET מבוססת FLIM התפתחה ככלי המספק כימות מדויק וספציפיות מרחבית למדידות העברת אנרגיה בין שתי מולקולות המבוססות על אורך החיים הפלואורסצנטי שלהם8. FLIM מודד את הזמן פלואורופור נשאר במצב נרגש לפני פולט פוטון והוא טוב יותר מאשר טכניקות המשתמשות מדידות אינטנסיביות לבד9,10. מלבד מערכות הטרולוגיות כגון Nicotiana benthamiana וקליפות אפידרמיס בצל, דיווחים אחרונים הראו את השימוש בשורשים Arabidopsis ושתילי אורז צעירים, וכו ', לניתוח ויוו של אינטראקציות חלבון חלבון בתנאים מקומיים11,12.
מלבד מערכת ביטוי מתאימה, הבחירה של שותפים אינטראקציה עבור BiFC ו FRET גיוסים הוא גם חיוני להצלחת הניסוי הזה. יש לאמת את ה- PPI בין השותפים המשמשים בתצורת BiFC באמצעות פקדים מתאימים לפני השימוש בהם כשותף מצומד בניסוי FRET13. BiFC מנצל את ההשלמה המבנית של חלקים N-ו- C-מסוף של חלבון פלורסנט. מגבלה נפוצה ברוב החלבונים הפלואורסצנטיים המשמשים בבוחות BiFC הייתה ההרכבה העצמית בין שני שברים נגזרים שאינם פלואורסצנטיים, מה שתרם לפלורסצנטיות חיובית כוזבת ומקטין את יחס האות לרעש (S/N)14. התפתחויות אחרונות, כולל מוטציות נקודתיות או מיקום של פיצול חלבון פלואורסצנטי, הולידו זוגות BiFC עם עוצמה מוגברת, ספציפיות גבוהה יותר, יחס S / N גבוה15,16. חלבונים פלואורסצנטיים אלה יכולים לשמש גם לביצוע BiFC בהתאם להתאמת הניסוי.
באופן מסורתי, CFP ו- YFP שימשו כזוג התורם והמקבל בניסויי FRET17. עם זאת, YFP או m-Citrine נמצאו תורמי FRET טובים יותר (כאשר נעשה שימוש עם RFP כמקובל) בגלל התשואה הקוונטית הגבוהה (QY) במהלך הביטוי הטבעי של חלבוני היעד במערכת השורש Arabidopsis. הבחירה של מקדמים (מרכיב לעומת יליד / אנדוגני) פלואורופור גם לשחק תפקיד מכריע בעיצוב ניסוי BiFC-FRET-FLIM מוצלח. חשוב לציין כי היעילות של תורמי FRET והתאמתם של זוגות FRET נוטים להשתנות עם השינוי במקדם ובמערכת הביולוגית המשמשת לביטוי. ה- QY של הפלורופור, המתייחס לבהירותו, תלוי ב- pH, בטמפרטורה ובמערכת הביולוגית הנמצאת בשימוש. אנו מציעים כי קריטריונים אלה ישקלו ביסודיות לפני בחירת זוג פלואורופור לניסוי FRET. המערכת הביולוגית, היזמים והחלבונים המשמשים לפרוטוקול זה עבדו היטב עם פלואורופורים CFP-YFP לניסוי BiFC FRET-FLIM.
במחקר הנוכחי, אנו משלבים את התכונה של FLIM כדי לדמיין את האינטראקציה בין שלוש מולקולות חלבון באמצעות FRET מבוסס BiFC. בטכניקה זו, שני חלבונים מתויגים עם חלבון YFP מפוצל ואת החלבון השלישי עם CFP. מכיוון שהתעניינו בחקר האינטראקציה של הומודימר חלבון תיבת MADS (M) עם חלבון חיישן סידן (C), חלבונים אלה תויגו עם חלבונים פלואורסצנטיים בווקטורים pSITE-1CA ו- pSITE-3CA18. שניים מהשותפים לאינטראקציה, ב-assay זה, תויגו עם חלקים N-ו- C-terminal של YFP ב pSPYNE-35S ו- pSPYCE-35S וקטורים19, והאינטראקציה שלהם גורמת לחזרה של YFP פונקציונלי הפועל כקבל FRET לשותף האינטראקציה השלישי, אשר מתויג עם CFP (מתנהג כתורם FRET) (איור 1 ). במקרה מסוים זה, ה- PPI בין שני מונומרים M ובין M ו- C אומת על ידי ביצוע BiFC בשלוש מערכות שונות יחד עם מערכת שמרים-שתיים-היברידית. וקטורים אלה גויסו לתוך זן אגרובקטריום tumifaciens GV3101 על ידי אלקטרופורציה. זן GV3101 יש pMP90 טי מנוטרל (pTiC58DT-DNA) עם התנגדות גנטמיצין20. זן אגרובקטריום p19 נוסף יחד עם כל ההסתננויות כדי למנוע השתקת transgene21. אנו ממליצים כי שלושת החלבונים ישמשו גם בקונפורמציות הפוכות כדי לאמת את האינטראקציות המשולשות.
בטכניקה זו, השתמשנו FLIM, שבו הראשון, חיי הפלואורסצנטיות של התורם (חיים תורם ללא יראתי) נמדד בהיעדר מקבל. לאחר מכן, חייו נמדדים בנוכחות המקבל (אורך חיים של תורם מרווה). הבדל זה במאסרי החיים של פלואורסצנטיות התורם משמש לחישוב יעילות FRET, אשר תלוי במספר הפוטונים המציגים ירידה בחיי הפלואורסצנטיות. להלן פרוטוקול מפורט כדי לקבוע את היווצרותו של קומפלקס טרנרי בין כל שלושה חלבונים על ידי ביטוי חולף של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ב- Nicotiana benthamiana ו- assaying האינטראקציה שלהם על ידי BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

אינטראקציות בין חלבונים לחלבון הן חלק בלתי נפרד מכל התהליכים הביולוגיים בתאים, שכן הן ממלאות תפקיד מכריע בוויסות, תחזוקה ותיקון של תפקודי התא. אינטראקציות אלה מעורבות במגוון רחב של תופעות כגון העברת אותות, תגובת פתוגן, אינטראקציות בין תאים, תהליכים מטבוליים והתפתחותיים. במקרה של גורמי שעתוק, אינטראקציות אלה עשויות להוביל אוליגומריזציה של subunits, הפרדה בהקשרים תת-תאיים ספציפיים כגון הגרעין, ציטופלסמה, וכו ', אשר, בתורו, עשוי להיות השפעה עמוקה יותר על הביטוי של הגנים במורד הזרם. כאן, אנו מדגימים מתודולוגיה כדי לדמיין אינטראקציה משולשת vivo באמצעות השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) מבוסס Förster העברת אנרגיה תהודה (FRET) מעורבים הדמיה לכל החיים פלואורסצנטי (FLIM). שניים מהחלבונים שנבחרו להדגמה זו מתקשרים כשותפים של BiFC, ופעילות הפלואורסצנטיות המחודשת שלהם משמשת לבדיקת FRET-FLIM עם השותף השלישי. צמחים בני ארבעה עד חמישה שבועות בני 4 עד 5 שבועות של צמחים מגידול תאית ניקוטיאנה בנתמיאנה שימשו כמערכת הצמחים לדוגמה להדגמה זו.

פרוטוקול זה מייצג שיטה ממוטבת לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון משולש vivo בצמחים. העיקרון הבסיסי של הפרוטוקול הוא לשלב שתי טכניקות אינטראקציה חלבון מתויג פלואורסצנטית, כלומר, BiFC ו FRET, כדי ליצור בדיקת כדי למדוד היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון. כאן, השתמשנו FLIM כדי למדוד את חיי הפ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.

קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

המחקר של אינטראקציות חלבון חלבון מספק הבנה של הרגולציה של תהליכים ביולוגיים רבים. כאן אנו מדגימים הליך המתואר בראשון תיבות על ידי נעל Y ג'ון ושות '. עובדים בשנת 2007, שם המחברים השתמשו BiFC בשילוב עם FRET כדי לאמת את האינטראקציה המשולשת בין שלוש מולקולות חלבון.עם זאת, כללנו מדידות לכל החיים פלואורסצנטיות בהליך זה כדי לבסס מדידות FRET. כדי להדגים אינטראקציה משולשת, בחרנו חלבון, אשר ידוע הומודימרה. יתר על כן, זה גם אומת בתוך הבית כדי לקיים אינטראקציה עם חיישן סידן של חלבון המכונה חלבון C בפרוטוקול זה.חלבוני MNC אינטראקציה בציטופלסמה. בטכניקה זו, שני חלבונים מתויגים עם חלבוני YFP מפוצלים. האינטראקציה שלהם גורמת לפיצוי של YFP פונקציונלי הפועלים כמקבל FRET לשותף האינטראקציה השלישי, אשר מתויג עם CFP מתנהג כתורם FRET.התחל עם הגברה של רצפי הקידוד של הגנים מעניינים שהם גנים M ו- C במקרה שלנו על ידי PCR ולשכפל אותם בווקטורים כניסה מתאימים. לאמת שיבוטים שנבחרו על אנטיביוטיקה המכילה צלחות על ידי עיכול הגבלה ורצף DNA. גייסו את תקליטורי ה- CDS המשוחזרים של שיבוטי הכניסה לווקטורי היעד.כל הווקטורים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלה הראשונה. לבסוף, להפוך את התאים אגרובקטריום GV3101 עם וקטורים היעד על ידי אלקטרופורציה. כאן אנו מגדלים צמחי ניקוטיאנה בנתמיאנה עדיין ארבעה עד שישה שלב לעזוב בתנאים מבוקרים בתא גידול.הכן את תערובת הקרקע על ידי ערבוב אדמה, כבול קוקו וקומפוסט ביחס של 2:1:1. מורחים שכבה בעובי 2.5 ס"מ של התערובת הזו במגש פלסטיק כדי להפוך את מיטת הקרקע ולהרוות אותה במעט מים. מפזרים כ -200 זרעים על גבי האדמה ומעבירים אותו למגש גדול יותר שקונטימטר אחד של מים עומדים.מכסים מגש זה בניילון נצמד ליצירת תא לחות. העבר מגש זה לתא גידול שנקבע ב 23 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 16 שעות ושמונה שעות כהה. לאחר שבועיים מעבירים את השתילים הצעירים לסירים קטנים של 3 עד 4 אינץ', המכילים תערובת אדמה רוויה במים.מניחים את הסירים האלה במגשי פלסטיק ומעבירים אותם לתא הגידול במשך ארבעה שבועות נוספים. עבור אגרואינפילציה, זני החיידקים צריכים להיות טריים תת-תרבית מעורב יחד עם זן P19 של אגרובקטריום ביחסים מתאימים. התחל הליך זה על ידי חנק זני אגרובקטריום GV3101 המכילים מבנים BiFC ו FRET מלוחות פסים ב 10 מ"ל.למרק המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. לצד זאת, ליזום גם תרבות של זן P19 של אגרובקטריה, אשר מתווסף כדי למנוע השתקה transgene. מכסים את הבקבוקון בנייר אלומיניום ושומרים אותם בשייקר אינקובטור, ומניחים אותו ב-28 מעלות צלזיוס ב-170 סל"ד למשך 16 שעות.לאחר העברת הצמיחה הלילית 1 מ"ל. של תרביות אלה לתא חד פעמי כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. מערבבים את התרבויות של שותף BiFC ו- FRET מתאים המכיל זנים כך OD הסופי הוא 0.5 וזה של P19 הוא 0.3 בנפח כולל של 2 מ"ל.כדי להשיג יחסים אלה אנו עוקבים אחר הנוסחה המוצגת על המסך עבור חישובים אלה. צנטריפוגות תרביות אגרובקטריום מעורב ב 3000G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להשליך את supernatant. להשעות את הכדורים ב 2 מ"ל.חוצץ חדירה. ייתכן שיהיה עליך להשתמש מערבל מערבולת להשעות מחדש את התאים בהשעיית תא הומוגני לחלוטין. לאחר מכן לדגור הצינורות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלוש שעות.בינתיים, לתייג כל עציץ לתערובת המבנה זה הולך להיות הסתנן עם. מלאו מזרק 1 מ"ל. ללא מחט בתערובת האגרובקטריאלית.לחץ בעדינות אך בחוזקה על קצה המזרק לצד האבקסיאלי של עלה מורחב לחלוטין תוך תמיכה בעליה מהצד השני. דוחפים בעדינות את הבוכנה עד שהתמיסה מתמלאת באזור העלה שווה ערך פי שניים עד שלושה מזה של קצה המזרק. לחדור את תערובת החיידקים עד ארבעה כתמים על עלה אחד ולחזור על הליך זה במשך שלושה עד ארבעה עלים עבור סוג אחד של חדירה.כמו כן, לכלול לפחות שני צמחים לכל מבנה לחדירה. זכור לנגב את הידיים עם 70% אלכוהול או לשנות את הכפפות שלך כדי למנוע כל זיהום צולב. מעבירים את כל הסירים למגש ודגרה בתא הצמיחה באותו מצב צמיחה.בדוק חלק קטן של העלה agroinfiltrated באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר הפלואורסצנטיות הן מ- YFP והן מ- CFP ניתנים לזיהוי בתאים ממשיכים למיקרוסקופ הקונפוקליבי לבדיקת BiFC FRET-FLIM. במקרה שלנו, ניתוח זה בוצע שלושה ימים לאחר סינון אגרואינפלציה.עכשיו כשהצמחים מוכנים להמחשה תחת מיקרוסקופ חתך דגימות עלים מרובעים מחמישה עד 8 מ"מ. הרחק מפצע קצה המזרק ולהרכיב אותם על מים מזוקקים. מניחים עליו כיסוי נקי וחותמים.דמיינו את הדגימות האלה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוצלי. בהליך זה, הבסיס לקביעת וכימות אינטראקציה בין שני חלבונים הוא הפחתת אורך החיים פלואורסצנטי של השותף התורם FRET על האינטראקציה שלה עם הקבלה, אשר משמש לחישוב היעילות של FRET. המורכבות במקרה של אינטראקציה משולשת עולה עוד יותר כי FRET מקבל במקרה זה הוא לא מולקולה אחת, אבל זוג YFP BiFC מפוצל, אשר צריך תחילה לקבל מחדש ב vivo להיות פלואורופור מקבל FRET פונקציונלי.כדי לבצע FRET-FLIM, אנחנו צריכים לקבוע את מולקולות התורם פלורסצנטיות לכל החיים, תחילה לבד ולאחר מכן בנוכחות שותף FRET. פתח את יישום FLIM במיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי, הפעל את הקונסולה והשתמש בספירת פוטון זיהוי התבניות כדי למדוד את משך החיים של פלואורסצנטיות. בחר את מצב מדידת ספירת הפוטונים הסטנדרטי.ניקח שני סוגים של צמחים מנודים. אחד שיש לו את הגן CCFP והשני שיש לו CCFP יחד עם MYFP מכיוון שהאינטראקציה של חלבון M כבר אומתה עם חלבון C באמצעות BiFC ו- Y2H, אנו מצפים ליעילות FRET טובה עם זוג אינטראקציה זה. עכשיו אנחנו סורקים תחילה את העלה agroinfiltrated CCFP ולחפש תא מראה פלואורסצנטיות CFP טובה.הגדרות המיקרוסקופ מוצגות על המסך. המדגם מואר בעוצמה לייזר מספקת כדי להשיג כ 0.1 פוטונים לכל פעימה. עבור דגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות משתנה, נתפוס 50 מסגרות כדי לאסוף פוטונים נאותים הנדרשים למדידה לכל החיים.כפי ש- CFP ידוע כמפגין שתי תקופות חיים פלואורסצנטיות עקב ההתאמה האישורית שלו, אנו מזינים את הנתונים באמצעות מודל reconvolution מעריכי תוך שמירה על הערך של N שווה לשניים. בהגדרות אלה, שתי תקופות החיים גלויות ב- 1 ו- 3.2 ננו-שניות. אנו נשתמש לאורך החיים הגבוה יותר עבור כל החישובים הבאים.כעת אנו מוגדרים למדוד FRET בין CCFP ו- MYFP. בשביל זה בואו להשתמש בדגימת העלים מהמפעל agroinfiltrated עם CCFP ו MYFP. אנו מחפשים תא המבטא הן CCFP והן MYFP ומאשרים את דפוסי הפליטה המתאימים שלהם על ידי מרגש אותם באמצעות לייזר דופק מלא של 40 ננומטר ולייזר אור לבן 514 ננומטר.לאחר מכן אנו עוברים למסוף FLIM כדי למדוד את משך החיים של CFP באמצעות אותן הגדרות בהן השתמשנו קודם לכן למדידת משך החיים של CCFP. אבל הפעם התא גם מבטא MYFP שיכול לקיים אינטראקציה פוטנציאלית עם CCFP ולגרום לירידה לאורך החיים של CCFP. כפי שקראנו את הגרף שהושג באמצעות מודל reconvolution מעריכי N עם N שווה לשניים, יש למעשה ירידה תוחלת החיים CFP מ 3.2 ל 2.6 ננו שניות.כעת אנו מפעילים את קונסולת FRET בתוכנה ומחשבים את יעילות FRET על ידי הזנת אורך חיים ללא עוררין באופן ידני במשוואה המסופקת בתוכנה ויעילות FRET הנצפית היא 56%עכשיו בואו נעבור לשלב הסופי, כלומר לדמיין את האינטראקציה בין שלושה שותפים. בשביל זה, אנחנו לוקחים את דגימת העלים מצמח כי היה בשיתוף עם CCFP ו MYFPN עם MYFPC. אנו סורקים את צמח העלים עבור תא המציג הן CFP והן פלואורסצנטיות YFP מחודשת הנובעת מאינטראקציה בין שני חלבוני M.אנו משתמשים באותו לייזר ואורך גל פליטה כפי שהיה בשימוש קודם לכן. לאחר מכן, נכבה את לייזר 514 ננומטר ונעבור לקונסולת FLIM. אם עמעום MYFP מקיים אינטראקציה עם CCFP.אנחנו צריכים לראות ירידה בחיים של CCFP כפי שנצפה במהלך האינטראקציה שלה עם MYFP. עם זאת, אם CCFP נכשל אינטראקציה עם DIMER MYFP, אורך החיים פלואורסצנטי שלה צריך להישאר לראות ב 3.2 ננו שניות. באמצעות ההגדרות הדומות כאמור לעיל, אנו מודדים את משך החיים של CFP בנוכחות YFP מחדש.אנו מתאימים לגרף באמצעות מודל ההתיישבות המעריכית N עם שוויון לשניים ועוברים לקונסולת FRET. וכן, יש ירידה בתוחלת החיים של CFP מ-3.2 ל-2.3 ננו-שניות. אנו מחשבים את יעילות FRET כמתואר לעיל.יעילות FRET המחושבת היא 55%כאן השתמשנו FLIM כדי למדוד את אורך החיים פלואורסצנטי של השותף התורם FRET בנוכחות ובהיעדר מקבל FRET. ירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם הייתה צפויה אם הייתה אינטראקציה חיובית בין שני החלבונים. במקרה של שליטה חיובית, כלומר CCFP ו- MYFP.אנו צופים ירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם מ 3.3 ל 2.5 ננו שניות ויעילות FRET היה 56%תרגיל דומה עם YFP מחדש נבע האינטראקציה בין שני אמונים וחלבוני C גם הביא אינטראקציה FRET חיובי המוביל לירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם ל 2.6 ננו שניות. יעילות FRET המחושבת הייתה כ -55% במקרה זה. הירידה בחיי הפלואורסצנטיות של תורם FRET מספקת ראיה חזקה לאינטראקציה משולשת בין חלבונים אלה.הפרוטוקול המתואר כאן הוא כלי רב עוצמה כדי לקבוע אינטראקציות חלבון משולש בתאים חיים. הליך זה יכול גם לסייע בקביעת לוקליזציה תאית של מתחמי התוצאה, אשר חשוב בפענוח הפונקציה ואת המשמעות הפיזיולוגית של כל קומפלקס חלבון. לסיכום, בדיקת FRET-FLIM מבוססת BiFC מספקת הזדמנות ללמוד ולאפיין היבטים חשובים של אינטראקציות חלבון משולשות, אשר יכול להיות מועיל במחקרים אינטראקציה חלבון חלבון במערכות בעלי חיים וצמחים.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...