Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC takker oppriktig University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE og Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) for sine stipendiatstillinger. Vi anerkjenner heldigvis Institutt for bioteknologi (DBT), Indias regjering, Institutt for vitenskap og teknologi (DST-FIST), Indias regjering for økonomisk støtte.

1. Kloning av gener i inngangs- og destinasjonsvektorer (Figur 2)
<ol><li>Forsterke kodesekvensen (CDS) av genene av interesse (M- og C-gener i vårt tilfelle) av PCR og klone dem i passende inngangsvektorer (f.eks. pENTR / D-TOPO vektor; se tabell 1 for vektorer som brukes i dette eksperimentet).</li>
	<li>Vokse klonene på plater som inneholder antibiotika. Valider kloner som er valgt på antibiotika ved begrensning fordøyelse ...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

Den nåværende protokollen demonstrerer bruken av BiFC-basert FRET-FLIM-analyse for å fastslå dannelsen av et ternært kompleks mellom to monomerer av et MADS-boksprotein og et kalsiumsensorprotein. Protokollen er tilpasset fra en rapport fra Y. John Shyu et al. hvor de har utviklet en BiFC-basert FRET-metode for å visualisere ternærkompleks dannet mellom Fos-Jun heterodimers og NFAT eller p65 ved hjelp av den sensibiliserte utslippsmetoden7. Tidligere ble et tre-fluorophore FRET-system utvik...

Proteinproteininteraksjoner (PPIer) danner grunnlaget for riktig funksjon av eukaryote celler ved å regulere ulike metabolske og utviklingsmessige prosesser. Noen PPIer er stabile, mens andre er forbigående i naturen. Interaksjonene kan kategoriseres basert på antall og type medlemmer i interaksjonen, for eksempel dimerisk, trimerisk, tetramerisk homomerisk og hetermerisk1. Identifisering og karakterisering av proteininteraksjoner kan føre til en bedre forståelse av proteinfunksjoner og regulatoriske nettverk.
Transkripsjonsfaktorer er proteiner som er involvert i regulatoriske funksjoner. De regulerer transkripsjonshastigheten av nedstrømsgenene sine ved å binde seg til DNA-et. Noen ganger er oligomerisering eller dannelse av høyere ordens komplekser av proteiner en forutsetning for å utføre sine funksjoner2. Plante MADS-boks transkripsjonsfaktorer er homøotiske gener som regulerer ulike prosesser som blomsterovergang, blomsterorganutvikling, befruktning, frøutvikling, senescence og vegetativ utvikling. De er kjent for å danne høyere ordenskomplekser som binder seg til DNA3,4. Å studere PPI-nettverk blant transkripsjonsfaktorer og deres interagere gir innsikt i kompleksiteten som ligger til grunn for transkripsjonsreguleringen.
Forbigående proteinuttrykk i Nikotiana benthamiana har vært en populær tilnærming for å studere proteinlokalisering eller proteinproteininteraksjoner i vivo5. BiFC og FRET er metoder for å studere proteinproteininteraksjoner in vivo ved hjelp av fluorescerende reportersystemer6. En kombinasjon av disse to teknikkene har vist seg å avsløre samspillet mellom tre proteiner7. FRET måles ved hjelp av akseptabel fotobleaching, sensibilisert utslipp og Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)-teknikk. FLIM-basert FRET-analyse har dukket opp som et verktøy som gir nøyaktig kvantifisering og romlig spesifisitet til energioverføringsmålinger mellom to molekyler basert på deres fluorescenslevetid8. FLIM måler tiden en fluorofor forblir i en spent tilstand før den avgir en foton og er bedre enn teknikker som bruker intensitetsmålinger alene9,10. Foruten heteroologe systemer som Nicotiana benthamiana og løk epidermal peeling, nyere rapporter har vist bruk av Arabidopsis røtter og unge risplanter, etc., for in vivo analyse av protein-protein interaksjoner under innfødte forhold11,12.
Bortsett fra et egnet uttrykkssystem, er valg av interagerende partnere for BiFC- og FRET-analyser også avgjørende for suksessen til dette eksperimentet. PPI blant partnere som brukes i BiFC-konfigurasjon, bør valideres ved hjelp av passende kontroller før bruk som en konjugert partner i FRET-eksperimentet13. BiFC benytter strukturell komplementering av N- og C-terminaldeler av fluorescerende protein. En vanlig begrensning i de fleste, om ikke alle fluorescerende proteiner som brukes i BiFC-analyser, har vært selvmonteringen mellom de to avledede ikke-fluorescerende fragmentene, noe som bidrar til falsk-positiv fluorescens og reduserer signal-til-støy (S / N) forholdet14. Nylige utviklinger, inkludert punktmutasjoner eller posisjon for å dele det fluorescerende proteinet, har gitt opphav til BiFC-par med økt intensitet, høyere spesifisitet, høyt S / N-forhold15,16. Disse fluorescerende proteinene kan også brukes til å utføre BiFC avhengig av eksperimentets egnethet.
Tradisjonelt har CFP og YFP blitt brukt som donor og akseptorpar i FRET-eksperimenter17. Imidlertid ble YFP eller m-Citrine funnet å være bedre FRET-givere (når de brukes med RFP som akseptor) på grunn av det høye kvanteutbyttet (QY) under det opprinnelige uttrykket av målproteiner i Arabidopsis rotsystem. Utvalget av promotører (konstituerende versus innfødt/ endogen) og fluorofor spiller også en avgjørende rolle i utformingen av et vellykket BiFC-FRET-FLIM-eksperiment. Det er viktig å merke seg at effektiviteten til FRET-givere og egnethet av FRET-par har en tendens til å endres med endringen i promotoren og det biologiske systemet som brukes til uttrykk. Fluoroforens QY, som er relatert til lysstyrken, avhenger av pH, temperatur og det biologiske systemet som er i bruk. Vi foreslår at disse kriteriene vurderes grundig før du velger fluoroforparet til FRET-eksperimentet. Det biologiske systemet, promotorene og proteinene som brukes til denne protokollen fungerte bra med CFP-YFP fluoroforer for BiFC FRET-FLIM-eksperimentet.
I den nåværende studien inkorporerer vi funksjonen til FLIM for å visualisere samspillet mellom tre proteinmolekyler ved hjelp av BiFC-basert FRET. I denne teknikken er to proteiner merket med delt YFP-protein og det tredje proteinet med CFP. Siden vi var interessert i å studere samspillet mellom et MADS-boksprotein (M) homodimer med et kalsiumsensorprotein (C), ble disse proteinene merket med fluorescerende proteiner i pSITE-1CA og pSITE-3CA vektorer18. To av de interagerende partnerne, i denne analysen, ble merket med N- og C-terminaldeler av YFP i pSPYNE-35S- og pSPYCE-35S-vektorene19, og deres interaksjon resulterer i rekonstituering av den funksjonelle YFP som fungerer som en FRET-akseptor til den tredje samhandlende partneren, som er merket med CFP (fungerer som FRET-donor) (Figur 1 ). I dette spesielle tilfellet har PPI mellom to M-monomerer og mellom M og C blitt validert ved å utføre BiFC i tre forskjellige systemer sammen med gjær-to-hybrid-systemet. Disse vektorene ble mobilisert til Agrobacterium tumifaciens GV3101 stamme ved elektroporasjon. GV3101-stammen har en avvæpnet Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens20. En p19 Agrobacterium stamme ble tilsatt sammen med alle infiltrasjoner for å forhindre transgene silencing21. Vi anbefaler at de tre proteinene også brukes i motsatte konformasjoner for å validere trepartsinteraksjonene.
I denne teknikken har vi ansatt FLIM, hvor først donorens fluorescenslevetid (uuttalt donorlevetid) måles i fravær av en akseptor. Deretter måles levetiden i nærvær av akseptoren (slukket donorlevetid). Denne forskjellen i donorfluorescenslevetid brukes til å beregne FRET-effektivitet, som avhenger av antall fotoner som viser en reduksjon i fluorescenslevetiden. Nedenfor er en detaljert protokoll for å bestemme dannelsen av et ternært kompleks mellom tre proteiner ved å transient uttrykke fluorescerende merkede proteiner i Nikotiana benthamiana og analyse av deres interaksjon av BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Proteinproteininteraksjoner er en integrert del av alle biologiske prosesser i cellene, da de spiller en avgjørende rolle i å regulere, vedlikeholde og endre cellulære funksjoner. Disse interaksjonene er involvert i et bredt spekter av fenomener som signaltransduksjon, patogenrespons, cellecelleinteraksjoner, metabolske og utviklingsmessige prosesser. Når det gjelder transkripsjonsfaktorer, kan disse interaksjonene føre til oligomerisering av underenheter, sequestering i spesifikke subcellulære sammenhenger som kjernen, cytoplasma, etc., som igjen kan ha en dypere effekt på uttrykket av nedstrømsgenene. Her demonstrerer vi en metodikk for å visualisere in vivo treparts interaksjon ved hjelp av Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) basert Förster Resonance Energy Transfer (FRET) som involverer Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). To av proteinene som er valgt for denne demonstrasjonen samhandler som BiFC-partnere, og deres rekonstituerte fluorescensaktivitet brukes til å analyse FRET-FLIM med den tredje partneren. Fire til fem uker gamle vekstkammerdyrkede Nicotiana benthamiana-anlegg har blitt brukt som modellanleggssystem for denne demonstrasjonen.

Denne protokollen representerer en optimalisert metode for å studere in vivo tripartit protein-protein interaksjoner i planter. Det grunnleggende prinsippet i protokollen er å kombinere to fluorescensmerkede proteininteraksjonsteknikker, det vil si BiFC og FRET, for å skape en analyse for å måle ternær kompleks formasjon mellom tre proteinpartnere. Her har vi brukt FLIM til å måle fluorescenslevetiden til FRET-giverpartneren i nærvær og fravær av FRET-akseptoren. En reduksjon i donorens fluorescenslev...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Her presenterer vi en metode for å visualisere ternær kompleks formasjon mellom tre proteinpartnere ved hjelp av fluorescerende merkede proteiner av BiFC-basert FRET-FLIM-analyse. Denne metoden er verdifull for å studere proteinproteininteraksjonskomplekser in vivo.

Bestemmelse av trepartsinteraksjon mellom to monomerer av en MADS-boks transkripsjonsfaktor og et kalsiumsensorprotein av BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Studien av proteinproteininteraksjoner gir en forståelse av reguleringen av mange biologiske prosesser. Her demonstrerer vi en prosedyre beskrevet i utgangspunktet av Y John sko og co. Arbeidere i 2007, hvor forfatterne har brukt BiFC i kombinasjon med FRET for å validere trepartsinteraksjonen mellom tre proteinmolekyler.Vi har imidlertid inkludert fluorescens livstidsmålinger i denne prosedyren for å underbygge FRET-målinger. For å demonstrere en trepartsinteraksjon har vi valgt et protein, som er kjent for å homodimerisere. Videre har det også blitt validert internt for å samhandle med en kalsiumsensor av protein referert til som C-protein i denne protokollen.MNC-proteinene interagerer i cytoplasma. I denne teknikken er to proteiner merket med delte YFP-proteiner. Deres interaksjon resulterer i gjenopprettelse av funksjonell YFP som fungerer som en FRET-akseptor til den tredje samhandlende partneren, som er merket med CFP som fungerer som en FRET-donor.Begynn med forsterkning av kodingssekvensene til genene av interesse som er M- og C-gener i vårt tilfelle av PCR og klone dem i passende inngangsvektorer. Valider kloner som er valgt på antibiotika som inneholder plater ved begrensning av fordøyelse og DNA-sekvensering. Mobiliser den rekonstituerte CDS-en fra inngangskloner til destinasjonsvektorene.Alle vektorene som brukes i dette eksperimentet er oppført i tabell én. Til slutt forvandler du agrobakterien GV3101-celler med destinasjonsvektorene ved elektroporasjon. Her inne vokser vi Nicotiana Benthamiana planter fortsatt fire til seks forlater scenen i kontrollerte forhold i et vekstkammer.Forbered jordblandingen ved å blande jord, kokostor torv og kompost i forholdet 2:1:1. Spred et 1-tommers tykt lag av denne blandingen i en plastbrett for å gjøre jordsengen og mette den med litt vann. Dryss ca 200 frø på toppen av jorda og overfør det til et større brett som omtrent en centimeter stående vann.Dekk denne skuffen med plastfolie for å skape et fuktighetskammer. Overfør denne skuffen til et vekstkammer satt til 23 grader celsius med 16-timers lys og åtte timers mørk syklus. Etter to uker overføre de unge plantene til små tre til fire tommers potter som inneholder vann mettet jordblanding.Legg disse pottene i et plastbrett og overfør dem til å vokse kammer i fire uker til. For agroinfiltrasjon må bakteriestammene være nykulturerte og blandet sammen med P19-stammen av agrobakterier i passende forhold. Start denne prosedyren ved å inokulere GV3101 agrobakteriestammer som inneholder BiFC- og FRET-konstruksjoner fra strekplater i 10 ml.til buljongen som inneholder passende antibiotika. Ved siden av, også starte en kultur av P19 stamme av agrobakterier, som er lagt til for å forhindre transgene silencing. Dekk kolben med aluminiumsfolie og hold dem i en inkubator shaker, sett den 28 grader celsius ved 170 RPM i 16 timer.Etter nattveksten overføres 1 ml. av disse kulturene til en engangs cubit for å måle den optiske tettheten ved 600 nanometer ved hjelp av et spektrofotometer. Bland kulturene til passende BiFC og FRET partner som inneholder stammer slik at den endelige OD er 0,5 Og P19 er 0,3 i et totalt volum på 2 ml.For å oppnå disse forholdene følger vi formelen som vises på skjermen for disse beregningene. Sentrifuger de blandede agrobakterikulturene ved 3000G i fem minutter ved romtemperatur og kast forsiktig supernatanten. Suspender pelletsene i en 2 ml.infiltrasjonsbuffer. Du må kanskje bruke en virvelblander for å suspendere cellene helt i en homogen celleoppheng. Etter dette inkuber rørene ved romtemperatur i mørket i tre timer.I mellomtiden merker du hver plantepotte for konstruksjonsblandingen den skal infiltreres med. Fyll en 1 ml. nålløs sprøyte med agrobakteriell blanding.Trykk forsiktig, men trykk sprøytespissen forsiktig til abaxialsiden av et fullt utvidet blad mens du støtter bladet fra den andre siden. Skyv stempelet forsiktig til oppløsningen fylles opp i bladområdet tilsvarende to til tre ganger som sprøytespissen. Infiltrer bakterieblandingen på opptil fire flekker på ett blad og gjenta denne prosedyren for tre til fire blader for en slags infiltrasjon.Inkluder også minst to planter per konstruksjon for infiltrasjon. Husk å tørke hendene med 70% alkohol eller bytt hansker for å forhindre krysskontaminering. Overfør alle pottene til et brett og inkuber i vekstkammeret i samme veksttilstand.Sjekk en liten del av det agroinfilterte bladet ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Når fluorescensen fra både YFP og CFP kan påvises i celler, fortsetter du til det konfiske mikroskopet for BiFC FRET-FLIM-analysen. I vårt tilfelle ble denne analysen utført tre dager etter agroinfiltrasjon.Nå som plantene er klare til å visualiseres under et mikroskop, kutt firkantede bladprøver fra fem til 8 mm. vekk fra sprøytespisssåret og monter dem på destillert vann. Sett en ren dekselslipp over den og tetning.Visualiser disse prøvene i konfekt laserskanning mikroskop. I denne prosedyren er grunnlaget for å bestemme og kvantifisere samspillet mellom to proteiner reduksjonen i fluorescenslevetiden til FRET-donorpartneren ved interaksjon med akseptoren, som brukes til å beregne effektiviteten til FRET. Kompleksiteten i tilfelle av trepartsinteraksjon øker ytterligere fordi FRET-akseptor i dette tilfellet ikke er et enkelt molekyl, men et delt YFP BiFC-par, som først skal få rekonstituert in vivo for å bli en funksjonell FRET-akseptor fluorofor.For å utføre FRET-FLIM må vi bestemme donormolekylene fluorescenslevetid, først alene og deretter i nærvær av en FRET-partner. Åpne FLIM-applikasjonen i det kondolerende laserskanningsmikroskopet, start konsollen og bruk mønstergjenkjenningsfotontellingen til å måle fluorescenslevetiden. Velg standard målemodus for fotontelling.Vi vil ta to typer agroinfiltrated planter. Den ene som har CCFP-genet og det andre som har CCFP sammen med MYFP fordi samspillet mellom M-protein allerede er validert med C-proteinet ved hjelp av BiFC og Y2H, forventer vi god FRET-effektivitet med dette interagerende paret. Nå skanner vi først CCFP-agroinfiltrert blad og ser etter en celle som viser god CFP-fluorescens.Mikroskopinnstillingene vises på skjermen. Prøven lyser tilstrekkelig lasereffekt for å oppnå ca. 0,1 fotoner per puls. For prøver med variabel fluorescensintensitet vil vi fange 50 bilder for å samle tilstrekkelige fotoner som kreves for levetidsmålingen.Siden CFP er kjent for å vise to fluorescenslevetider på grunn av sin konfirmasjonstilpasning, mater vi dataene ved hjelp av en eksponentiell rekonvolusjonsmodell samtidig som verdien av N er lik to. Ved disse innstillingene er de to levetidene synlige på en og 3,2 nanoseconds. Vi vil bruke den høyere levetiden for alle etterfølgende beregninger.Vi er nå satt til å måle FRET mellom CCFP og MYFP. For dette, la oss bruke bladprøven fra den agroinfilterte planten med CCFP og MYFP. Vi ser etter en celle som uttrykker både CCFP og MYFP og bekrefter deres respektive utslippsmønstre ved å spennende dem ved hjelp av full 40 nanometer pulslaser og 514 nanometer hvitlyslaser.Deretter bytter vi til FLIM-konsollen for å måle levetiden til CFP ved hjelp av de samme innstillingene som vi brukte tidligere for å måle levetiden til CCFP. Men denne gangen uttrykker cellen også MYFP som potensielt kan samhandle med CCFP og forårsake en reduksjon i levetiden til CCFP. Som vi har lest grafen oppnådd ved hjelp av N eksponentiell rekonvolusjonsmodell med N lik to, er det faktisk en nedgang i CFP-levetiden fra 3,2 til 2,6 nanoseconds.Vi starter nå FRET-konsollen i programvaren og beregner FRET-effektiviteten ved å manuelt gå inn i ubestridelig levetid i ligningen som er gitt i programvaren, og den observerte FRET-effektiviteten er 56%La oss gå til det siste trinnet, det vil si å visualisere samspillet mellom tre partnere. For dette tar vi bladprøven fra en plante som ble infiltrert med CCFP og MYFPN med MYFPC. Vi skanner bladanlegget for en celle som viser både CFP og rekonstituert YFP-fluorescens som kommer fra interaksjon mellom to M-proteiner.Vi bruker samme laser- og utslippsbølgelengde som tidligere. Deretter slår vi av 514 nanometerlaseren og flytter til FLIM-konsollen. Hvis MYFP-dimmeren samhandler med CCFP.Vi bør se en reduksjon i levetiden til CCFP som observert under interaksjonen med MYFP. Imidlertid, hvis CCFP ikke klarer å samhandle med MYFP-dimmeren, bør fluorescenslevetiden forbli sett ved 3,2 nanoseconds. Ved å bruke de samme innstillingene som nevnt ovenfor, måler vi CFP-levetiden i nærvær av rekonstituert YFP.Vi tilpasser grafen ved hjelp av N eksponentiell rekonvolusjonsmodell med lik to og flytter til FRET-konsollen. Og ja, det er en nedgang i CFP-levetiden fra 3,2 til 2,3 nanoseconds. Vi beregner FRET-effektiviteten som beskrevet ovenfor.Den beregnede FRET-effektiviteten er 55%Her har vi brukt FLIM til å måle fluorescenslevetiden til FRET-donorpartneren i nærvær og fravær av FRET-akseptoren. En reduksjon i donorens fluorescenslevetid var forventet hvis det var en positiv interaksjon mellom de to proteinene. Ved positiv kontroll er det CCFP og MYFP.Vi observerer en reduksjon i donorens fluorescenslevetid fra 3,3 til 2,5 nanosekonds, og FRET-effektiviteten var 56%En lignende øvelse med rekonstituert YFP resulterte i samspillet mellom to amonomerer og C-proteiner resulterte også i en positiv FRET-interaksjon som førte til reduksjon i fluorescenslevetiden til donoren til 2,6 nanosekunderte. Den beregnede FRET-effektiviteten var omtrent 55%i dette tilfellet. Reduksjonen i fluorescenslevetiden til FRET-donoren gir et sterkt bevis for en trepartsinteraksjon mellom disse proteinene.Protokollen beskrevet her er et kraftig verktøy for å bestemme treparts proteinproteininteraksjoner i levende celler. Denne prosedyren kan også bidra til å bestemme den intracellulære lokaliseringen av de resulterende kompleksene, noe som er viktig for å dechiffrere funksjonen og fysiologisk betydning av ethvert proteinkompleks. Til slutt gir BiFC-basert FRET-FLIM-analyse en mulighet til å studere og karakterisere viktige aspekter ved trepartsproteininteraksjoner, noe som kan være nyttig i proteinproteininteraksjonsstudier i både dyre- og plantesystemer.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase Affinity Capture Assay hjelp av magnetiske perler å studere protein-Protein Interaction: Den poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Rensing-fri metode for Binding Affinity Fastsettelse av mikroskala Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Karakterisering av G-protein-koblede reseptorer ved en fluorescens-basert Kalsium Mobilisering analysen

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Bestemmelse av protein-ligand interaksjoner Bruke Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...