Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC agradecem sinceramente à Comissão de Subsídios Universitários (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR) por suas bolsas de pesquisa. Agradecemos, felizmente, o Departamento de Biotecnologia (DBT), o Governo da Índia, o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST-FIST), o Governo da Índia pelo apoio financeiro.

1. Clonagem de genes em vetores de entrada e destino (Figura2)
<ol><li>Amplie a sequência de codificação (CDS) dos genes de interesse (genes M e C em nosso caso) por PCR e clone-os em vetores de entrada apropriados (por exemplo, vetor pENTR/D-TOPO; ver Tabela 1 para vetores usados neste experimento).</li>
	<li>Cresça os clones em placas contendo antibióticos. Validar clones selecionados nos antibióticos por restrição de di...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

O presente protocolo demonstra o uso de ensaios FRET-FLIM baseados em BiFC para verificar a formação de um complexo ternário entre dois monômeros de uma proteína de caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio. O protocolo é adaptado a partir de um relatório de Y. John Shyu et al. onde eles desenvolveram um método FRET baseado em BiFC para visualizar complexo ternário formado entre heterodimers Fos-Jun e NFAT ou p65 usando o método de emissão sensibilizado7. Anteriormente, um sistema...

As interações proteína-proteína (PPIs) formam a base do bom funcionamento das células eucarióticas regulando vários processos metabólicos e de desenvolvimento. Alguns PPIs são estáveis, enquanto outros são transitórios na natureza. As interações podem ser categorizadas com base no número e tipo de membros na interação, como dimeric, trimeric, tetramérrico homomédico e heteromérico1. A identificação e caracterização das interações proteicas pode levar a uma melhor compreensão das funções proteicas e das redes regulatórias.
Os fatores de transcrição são proteínas que estão envolvidas em funções regulatórias. Eles regulam a taxa de transcrição de seus genes a jusante ligando-se ao DNA. Às vezes, a oligomerização ou formação de complexos de alta ordem por proteínas é um pré-requisito para a realização de suas funções2. Os fatores de transcrição da caixa MADS são genes homeóticos que regulam vários processos como transição floral, desenvolvimento de órgãos florais, fertilização, desenvolvimento de sementes, senescência e desenvolvimento vegetativo. Eles são conhecidos por formar complexos de alta ordem que se ligam ao DNA3,4. Estudar as redes de PPI entre fatores de transcrição e seus interagirres fornece insights sobre a complexidade subjacente à regulação transcricional.
A expressão proteica transitória em Nicotiana benthamiana tem sido uma abordagem popular para estudar a localização de proteínas ou interações proteína-proteína in vivo5. BiFC e FRET são métodos para estudar interações proteína-proteína in vivo usando sistemas de repórteres fluorescentes6. Uma combinação dessas duas técnicas tem sido demonstrada para revelar a interação entre três proteínas7. O FRET é medido usando a técnica de fotobleaching aceitador, emissão sensibilizada e Fluorescência Lifetime Imaging (FLIM). O ensaio FRET baseado em FLIM surgiu como uma ferramenta que fornece quantificação precisa e especificidade espacial para medições de transferência de energia entre duas moléculas com base em suas vidas de fluorescência8. FLIM mede o tempo em que um fluorohore permanece em estado animado antes de emitir um fóton e é melhor do que técnicas que usam medidas de intensidadesozinhas 9,10. Além de sistemas heterologos como nicotiana benthamiana e cascas epidérmicas de cebola, relatórios mais recentes demonstraram o uso de raízes arabidopsis e mudas de arroz jovens, etc., para análise in vivo de interações proteína-proteína em condições nativas11,12.
Além de um sistema de expressão adequado, a seleção de parceiros interajantes para ensaios BiFC e FRET também é crucial para o sucesso deste experimento. O PPI entre os parceiros utilizados na configuração biFC deve ser validado utilizando controles apropriados antes de seu uso como parceiro conjugado no experimento FRET13. O BiFC utiliza a complementação estrutural das partes terminais N e C da proteína fluorescente. Uma limitação comum na maioria, se não todas as proteínas fluorescentes utilizadas nos ensaios biFC tem sido o auto-montagem entre os dois fragmentos não fluorescentes derivados, contribuindo para a fluorescência falso-positiva e diminui a razão sinal-ruído (S/N)razão 14. Desenvolvimentos recentes, incluindo mutações pontuais ou posição de divisão da proteína fluorescente, deram origem a pares de BiFC com maior intensidade, maior especificidade, alta razão S/N15,16. Essas proteínas fluorescentes também podem ser usadas para a realização de BiFC, dependendo da adequação do experimento.
Tradicionalmente, CFP e YFP têm sido usados como o doador e o par de aceitadores em experimentos FRET17. No entanto, YFP ou m-Citrine foram encontrados como melhores doadores de FRET (quando usados com RFP como aceitador) devido ao alto rendimento quântico (QY) durante a expressão nativa de proteínas-alvo no sistema raiz arabidopsis. A seleção de promotores (constitutivo versus nativo/endógeno) e fluorógono também desempenham um papel crucial na concepção de um experimento bifc-fret-flim bem sucedido. É essencial notar que a eficiência dos doadores de FRET e a adequação dos pares FRET tendem a mudar com a mudança no promotor e no sistema biológico que está sendo utilizado para a expressão. O QY do fluoróforo, que se relaciona com seu brilho, depende do pH, temperatura e do sistema biológico em uso. Sugerimos que esses critérios sejam cuidadosamente considerados antes de escolher o par fluoróforo para o experimento FRET. O sistema biológico, os promotores e as proteínas utilizadas para este protocolo funcionaram bem com fluoroforos CFP-YFP para o experimento BiFC FRET-FLIM.
No presente estudo, incorporamos a característica da FLIM para visualizar a interação entre três moléculas de proteínas utilizando FRET baseada em BiFC. Nesta técnica, duas proteínas são marcadas com proteína YFP dividida e a terceira proteína com PCP. Como estávamos interessados em estudar a interação de um homodimer de proteína mads-box (M) com uma proteína sensor de cálcio (C), essas proteínas foram marcadas com proteínas fluorescentes nos vetores pSITE-1CA e pSITE-3CA18. Dois dos parceiros interativos, neste ensaio, foram marcados com partes terminais N e C do YFP nos vetores pSPYNE-35S e pSPYCE-35S19, e sua interação resulta na reconstituição do YFP funcional que atua como um aceitador de FRET para o terceiro parceiro interagente, que é marcado com CFP (atuando como doador de FRET) (Figura 1 ). Neste caso específico, o PPI entre dois monômeros M e entre M e C foi validado realizando BiFC em três sistemas diferentes, juntamente com o sistema levedura-dois-híbridos. Esses vetores foram mobilizados na cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por eletroporação. A cepa GV3101 tem um pMP90 de Ti plasmídeo desarmado (pTiC58DT-DNA) com resistência à gentamicina20. Uma cepa p19 Agrobacterium foi adicionada juntamente com todas as infiltrações para evitar o silenciamento transgene21. Recomendamos que as três proteínas também sejam usadas em conformações opostas para validar as interações tripartites.
Nesta técnica, utilizamos flim, onde primeiro, a vida fluorescência do doador (vida de doador nãonchado) é medida na ausência de um aceitor. Depois disso, sua vida útil é medida na presença do aceitador (extinto de vida do doador). Essa diferença na vida útil da fluorescência de doadores é usada para calcular a eficiência do FRET, que depende do número de fótons que apresentam uma redução na vida útil da fluorescência. Mencionado abaixo é um protocolo detalhado para determinar a formação de um complexo ternário entre quaisquer três proteínas expressando transitoriamente as proteínas fluorescentes marcadas em Nicotiana benthamiana e avaliando sua interação pelo BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

As interações proteína-proteína são parte integrante de todos os processos biológicos das células, pois desempenham um papel crucial na regulação, manutenção e alteração das funções celulares. Essas interações estão envolvidas em uma ampla gama de fenômenos, como transdução de sinais, resposta de patógenos, interações célula-células, processos metabólicos e de desenvolvimento. No caso dos fatores de transcrição, essas interações podem levar à oligomerização de subunidades, sequestre em contextos subcelulares específicos como o núcleo, citoplasma, etc., que, por sua vez, podem ter um efeito mais profundo na expressão dos genes a jusante. Aqui, demonstramos uma metodologia para visualizar a interação tripartite in vivo usando a Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) baseada em Förster Resonance Energy Transfer (FRET) envolvendo Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Duas das proteínas selecionadas para esta demonstração interagem como parceiros do BiFC, e sua atividade de fluorescência reconstituída é usada para avaliar o FRET-FLIM com o terceiro parceiro. As plantas nicotiana benthamiana, cultivadas em quatro a cinco semanas, foram usadas como o sistema de plantas modelo para esta demonstração.

Este protocolo representa um método otimizado para estudar interações proteína-proteína in vivo tripartite nas plantas. O princípio básico do protocolo é combinar duas técnicas de interação proteica marcadas por fluorescência, ou seja, BiFC e FRET, para criar um ensaio para medir a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos. Aqui, utilizamos a FLIM para medir a vida fluorescência do parceiro doador DA FRET na presença e ausência do aceitador da FRET. Esperava-se uma redução...

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Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.

Determinação da interação tripartite entre dois monômeros de um fator de transcrição da caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio por Ensaio BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

O estudo das interações proteína-proteína proporciona uma compreensão da regulação de muitos processos biológicos. Aqui demonstramos um procedimento descrito inicial por Y John sapato e co. Trabalhadores em 2007, onde os autores usaram o BiFC em combinação com o FRET para validar a interação tripartite entre três moléculas de proteínas.No entanto, incluímos medidas de vida de fluorescência neste procedimento para comprovar as medidas de FRET. Para demonstrar uma interação tripartite, escolhemos uma proteína, que é conhecida por homodimerizar. Além disso, também foi validado internamente para interagir com um sensor de cálcio de proteína referido como proteína C neste protocolo.As proteínas MNC interagem no citoplasma. Nesta técnica, duas proteínas são marcadas com proteínas YFP divididas. Sua interação resulta na restituição do YFP funcional que atua como um aceitador de FRET para o terceiro parceiro interagindo, que é marcado com CFP atuando como um doador de FRET.Comece com a amplificação das sequências de codificação dos genes de interesse que são genes M e C em nosso caso pelo PCR e clone-os em vetores de entrada apropriados. Validar clones selecionados nos antibióticos que contêm placas por digestão de restrição e sequenciamento de DNA. Mobilize os clones de entrada do CDS reconstituídos para os vetores de destino.Todos os vetores usados neste experimento estão listados na tabela um. Por fim, transforme as células agrobacterium GV3101 com os vetores de destino por eletroporação. Aqui cultivamos as plantas Nicotiana Benthamiana ainda de quatro a seis etapas de licença em condições controladas em uma câmara de cultivo.Prepare a mistura do solo misturando solo, turfa de coco e adubo em uma proporção de 2:1:1. Espalhe uma camada de uma polegada de espessura desta mistura em uma bandeja de plástico para fazer o leito do solo e satura-lo com um pouco de água. Polvilhe cerca de 200 sementes em cima do solo e transfira para uma bandeja maior que cerca de um centímetro de água parada.Cubra esta bandeja com plástico para criar uma câmara de umidade. Transfira esta bandeja para uma câmara de cultivo a 23 graus centígrados com 16 horas de luz e ciclo escuro de oito horas. Após duas semanas, transfira as mudas jovens para pequenos vasos de três a quatro polegadas contendo mistura de solo saturado de água.Coloque esses potes em uma bandeja de plástico e transfira-os para cultivar câmara por mais quatro semanas. Para a agroinfiltração, as cepas bacterianas precisam ser recém-subculturadas e misturadas juntamente com a cepa P19 de agrobacterium em proporções apropriadas. Inicie este procedimento inoculando cepas de agrobacterium GV3101 contendo construções BiFC e FRET a partir de placas de raia em 10 ml.ao caldo contendo antibióticos apropriados. Paralelamente, também iniciamos uma cultura de cepa P19 de agrobactérias, que é adicionada para evitar o silenciamento transgene. Cubra o frasco com papel alumínio e mantenha-o em um agitador de incubadora, coloque-o 28 graus centígrados a 170 RPM por 16 horas.Após a transferência de crescimento durante a noite 1 ml. dessas culturas para um cubit descartável para medir a densidade óptica em 600 nanômetros usando um espectrofotômetro. Misture as culturas do parceiro BiFC e FRET apropriados contendo cepas para que o OD final seja 0,5 E o de P19 seja 0,3 em um volume total de 2 ml.Para alcançar essas proporções seguimos a fórmula mostrada na tela para esses cálculos. Centrifugar as culturas de agrobacterium mistas a 3000G por cinco minutos à temperatura ambiente e descartar cuidadosamente o sobrenatário. Suspenda as pelotas em 2 ml.tampão de infiltração. Você pode ter que usar um misturador de vórtice para re-suspender as células em uma suspensão celular homogênea completamente. Depois disso, incubar os tubos à temperatura ambiente no escuro por três horas.Enquanto isso, rotule cada vaso de planta para a mistura de construção com a sua vez. Encha uma seringa sem agulha de 1 ml com a mistura agrobacteriana.Pressione suavemente, mas firmemente, a ponta da seringa para o lado abaxial de uma folha totalmente expandida enquanto suporta a folha do outro lado. Empurre suavemente o êmbolo até que a solução se encha na área da folha equivalente a duas a três vezes a ponta da seringa. Infiltrar a mistura bacteriana em até quatro pontos em uma folha e repetir este procedimento para três a quatro folhas para um tipo de infiltração.Além disso, inclua pelo menos duas plantas por construção para infiltração. Lembre-se de limpar as mãos com 70% de álcool ou trocar as luvas para evitar qualquer contaminação cruzada. Transfira todos os potes para uma bandeja e incubar na câmara de crescimento na mesma condição de crescimento.Verifique uma pequena parte da folha agroinfiltada usando um microscópio de fluorescência. Quando a fluorescência de YFP e CFP são detectáveis em células proceder ao microscópio confocal para o ensaio BiFC FRET-FLIM. No nosso caso, essa análise foi realizada três dias após a agroinfiltração.Agora que as plantas estão prontas para serem visualizadas sob um microscópio corte amostras de folhas quadradas de cinco a 8 mm. longe da ferida da ponta da seringa e montá-las em água destilada. Coloque uma tampa limpa sobre ele e selado.Visualize essas amostras no microscópio de varredura a laser confocal. Neste procedimento, a base de determinação e quantificação da interação entre duas proteínas é a redução da vida fluorescência do parceiro doador DA FRET após sua interação com o aceitador, que é utilizado para calcular a eficiência do FRET. A complexidade no caso da interação tripartite aumenta ainda mais porque o aceitador da FRET neste caso não é uma única molécula, mas um par YFP BiFC dividido, que deve primeiro ser reconstituído in vivo para se tornar um fluoróforo iscotado funcional.Para realizar o FRET-FLIM, temos que determinar a fluorescência das moléculas doadoras ao longo da vida, primeiro sozinhas e depois na presença de um parceiro FRET. Abra o aplicativo FLIM no microscópio de varredura a laser confocal, inicie o console e use a contagem de fótons de reconhecimento de padrão para medir a vida útil da fluorescência. Selecione o padrão todo o modo de medição de contagem de fótons.Vamos levar dois tipos de plantas agroinfiladas. Um que tenha o gene CCFP e o outro que tenha CCFP junto com MYFP porque a interação da proteína M já foi validada com a proteína C usando BiFC e Y2H, esperamos boa eficiência de FRET com esse par de interação. Agora primeiro escaneamos a folha agroinfiltada CCFP e procuramos por uma célula mostrando boa fluorescência cfp.As configurações do microscópio são mostradas na tela. A amostra é iluminada a potência laser suficiente para alcançar aproximadamente 0,1 fótons por pulso. Para amostras com intensidade variável de fluorescência, capturaremos 50 quadros para coletar fótons adequados necessários para a medição vitalícia.Como o PCP é conhecido por exibir duas vidas de fluorescência devido à sua adaptação confirmacional, alimentamos os dados usando um modelo de reconvolução exponencial, mantendo o valor de N igual a dois. Nessas configurações, as duas vidas são visíveis em um e 3,2 nanossegundos. Usaremos a vida útil mais alta para todos os cálculos subsequentes.Estamos agora definidos para medir fret entre CCFP e MYFP. Para isso vamos usar a amostra de folha da planta agroinfiltada com CCFP e MYFP. Procuramos uma célula que expresse tanto o CCFP quanto o MYFP e confirmemos seus respectivos padrões de emissão, excitando-os usando laser de pulso de 40 nanômetros completo e laser de luz branca de 514 nanômetros.Depois disso, mudamos para o console FLIM para medir a vida útil do CFP usando as mesmas configurações que usamos anteriormente para medir a vida útil do CCFP. Mas desta vez a célula também está expressando MYFP que pode potencialmente interagir com o CCFP e causar uma redução na vida útil do CCFP. Como lemos o gráfico obtido usando o modelo de reconvolução exponencial N com N igual a dois, há de fato uma diminuição na vida útil do PCP de 3,2 para 2,6 nanossegundos.Agora iniciamos o console FRET no software e calculamos a eficiência do FRET inserindo manualmente a vida útil inquestionável na equação fornecida no software e a eficiência observada do FRET é de 56%Agora vamos passar para a etapa final, que é visualizar a interação entre três parceiros. Para isso, pegamos a amostra de folha de uma planta que foi co-infiltrada com CCFP e MYFPN com MYFPC. Escaneamos a planta de folhas para uma célula que mostra tanto a fluorescência YFP reconstituída emanando da interação entre duas proteínas M.Usamos o mesmo comprimento de onda de laser e emissão usado anteriormente. Posteriormente, desligamos o laser de 514 nanômetros e nos movemos para o console FLIM. Se o dimer MYFP interagir com o CCFP.Devemos ver uma redução na vida útil do CCFP como observado durante sua interação com o MYFP. No entanto, se o CCFP não interagir com o dimer MYFP, sua vida útil de fluorescência deve permanecer vista em 3,2 nanossegundos. Utilizando as configurações semelhantes às mencionadas acima, medimos a vida útil do CFP na presença de YFP reconstituído.Encaixamos o gráfico usando o modelo de reconvolução exponencial N com um igual a dois e movemos para o console FRET. E sim, há um declínio na vida útil do CFP de 3,2 para 2,3 nanossegundos. Calculamos a eficiência do FRET como descrito acima.A eficiência calculada do FRET é de 55%Aqui usamos o FLIM para medir a vida útil da fluorescência do parceiro doador FRET na presença e ausência do aceitor da FRET. Esperava-se uma redução na vida de fluorescência do doador se houvesse uma interação positiva entre as duas proteínas. Em caso de controle positivo, ou seja, CCFP e MYFP.Observamos uma redução na vida útil da fluorescência do doador de 3,3 para 2,5 nanossegundos e a eficiência do FRET foi de 56%Um exercício semelhante com YFP reconstituído resultou da interação entre dois amonomers e proteínas C também resultou em uma interação positiva de FRET levando à redução da vida útil da fluorescência do doador para 2,6 nanossegundos. A eficiência calculada do FRET foi de cerca de 55% neste caso. A redução da vida fluorescência do doador DE FRET fornece uma forte evidência para uma interação tripartite entre essas proteínas.O protocolo descrito aqui é uma ferramenta poderosa para determinar interações tripartites proteína-proteína em células vivas. Este procedimento também pode ajudar a determinar a localização intracelular dos complexos resultantes, o que é importante na decifração da função e da significância fisiológica de qualquer complexo proteico. Em conclusão, o ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC oferece uma oportunidade de estudar e caracterizar aspectos importantes das interações proteicas tripartites, que podem ser úteis em estudos de interação proteína-proteína em sistemas animais e vegetais.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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