Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

NB, GG, SB, KC agradecen sinceramente a la Comisión de Becas Universitarias (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE y el Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) por sus becas de investigación. Afortunadamente, agradecemos al Departamento de Biotecnología (DBT), al Gobierno de la India, al Departamento de Ciencia y Tecnología (DST-FIST), al Gobierno de la India por su apoyo financiero.

1. Clonación de genes en vectores de entrada y destino (Figura2)
<ol><li>Amplificar la secuencia codificante (CDS) de los genes de interés (genes M y C en nuestro caso) mediante PCR y clonarlos en vectores de entrada apropiados (por ejemplo, vector pENTR/D-TOPO; ver Tabla 1 para los vectores utilizados en este experimento).</li>
	<li>Cultive los clones en placas que contengan antibióticos. Validar clones que se seleccionan en l...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

El presente protocolo demuestra el uso del ensayo FRET-FLIM basado en BiFC para determinar la formación de un complejo ternario entre dos monómeros de una proteína MADS-box y una proteína sensora de calcio. El protocolo está adaptado de un informe de Y. John Shyu et al. donde han desarrollado un método FRET basado en BiFC para visualizar el complejo ternario formado entre heterodímeros de Fos-Jun y NFAT o p65 utilizando el método de emisión sensibilizada7. Anteriormente, galperin y sus co...

Las interacciones proteína-proteína (IBP) forman la base del buen funcionamiento de las células eucariotas mediante la regulación de diversos procesos metabólicos y de desarrollo. Algunos IBP son estables, mientras que otros son de naturaleza transitoria. Las interacciones se pueden clasificar en función del número y tipo de miembros en la interacción, como diméricos, triméricos, tetrámeros homoméricos y heteroméricos1. La identificación y caracterización de las interacciones proteicas puede conducir a una mejor comprensión de las funciones proteicas y las redes reguladoras.
Los factores de transcripción son proteínas que están involucradas en las funciones reguladoras. Regulan la velocidad de transcripción de sus genes aguas abajo uniéndose al ADN. A veces, la oligomerización o formación de complejos de orden superior por proteínas es un requisito previo para llevar a cabo sus funciones2. Los factores de transcripción MADS-box de plantas son genes homeóticos que regulan diversos procesos como la transición floral, el desarrollo de órganos florales, la fertilización, el desarrollo de semillas, la senescencia y el desarrollo vegetativo. Se sabe que forman complejos de orden superior que se unen al ADN3,4. El estudio de las redes PPI entre los factores de transcripción y sus interactores proporciona información sobre la complejidad subyacente a la regulación transcripcional.
La expresión transitoria de proteínas en Nicotiana benthamiana ha sido un enfoque popular para estudiar la localización de proteínas o las interacciones proteína-proteína in vivo5. BiFC y FRET son métodos para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo utilizando sistemas de reportero fluorescente6. Se ha demostrado que una combinación de estas dos técnicas revela la interacción entre tres proteínas7. FreT se mide mediante fotoblanqueo aceptor, emisión sensibilizada y técnica de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM). El ensayo FRET basado en FLIM ha surgido como una herramienta que proporciona cuantificación precisa y especificidad espaciotemporal a las mediciones de transferencia de energía entre dos moléculas en función de sus vidas de fluorescencia8. FLIM mide el tiempo que un fluoróforo permanece en un estado excitado antes de emitir un fotón y es mejor que las técnicas que utilizan medidas de intensidad solas9,10. Además de los sistemas heterólogos como Nicotiana benthamiana y las cáscaras epidérmicas de cebolla, informes más recientes han demostrado el uso de raíces de Arabidopsis y plántulas de arroz jóvenes, etc., para el análisis in vivo de las interacciones proteína-proteína en condiciones nativas11,12.
Además de un sistema de expresión adecuado, la selección de socios que interactúan para los ensayos BiFC y FRET también es crucial para el éxito de este experimento. El PPI entre los socios utilizados en la configuración de BiFC debe validarse utilizando los controles apropiados antes de su uso como socio conjugado en el experimento FRET13. BiFC utiliza la complementación estructural de las partes N- y C-terminal de la proteína fluorescente. Una limitación común en la mayoría, si no en todas, las proteínas fluorescentes utilizadas en los ensayos de BiFC ha sido el autoensamblaje entre los dos fragmentos derivados no fluorescentes, lo que contribuye a la fluorescencia falsa positiva y disminuye la relación señal-ruido (S / N)14. Los desarrollos recientes, incluidas las mutaciones puntuales o la posición de división de la proteína fluorescente, han dado lugar a pares biFC con mayor intensidad, mayor especificidad, alta relación S / N15,16. Estas proteínas fluorescentes también se pueden utilizar para llevar a cabo BiFC dependiendo de la idoneidad del experimento.
Tradicionalmente, CFP y YFP se han utilizado como el par donante y aceptor en experimentos FRET17. Sin embargo, se encontró que YFP o m-citrino son mejores donantes de FRET (cuando se usan con RFP como aceptor) debido al alto rendimiento cuántico (QY) durante la expresión nativa de proteínas objetivo en el sistema radicular de Arabidopsis. La selección de promotores (constitutivos versus nativos/endógenos) y fluoróforos también juegan un papel crucial en el diseño de un exitoso experimento BiFC-FRET-FLIM. Es esencial tener en cuenta que la eficiencia de los donantes fret y la idoneidad de los pares FRET tienden a cambiar con el cambio en el promotor y el sistema biológico que se utiliza para la expresión. El QY del fluoróforo, que se relaciona con su brillo, depende del pH, la temperatura y el sistema biológico en uso. Sugerimos que estos criterios se consideren a fondo antes de elegir el par de fluoróforos para el experimento FRET. El sistema biológico, los promotores y las proteínas utilizadas para este protocolo funcionaron bien con los fluoróforos CFP-YFP para el experimento BiFC FRET-FLIM.
En el presente estudio, incorporamos la característica de FLIM para visualizar la interacción entre tres moléculas de proteína utilizando FRET basado en BiFC. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteína YFP dividida y la tercera proteína con PPC. Dado que estábamos interesados en estudiar la interacción de un homodímero de proteína MADS-box (M) con una proteína sensora de calcio (C), estas proteínas fueron marcadas con proteínas fluorescentes en vectores pSITE-1CA y pSITE-3CA18. Dos de los socios que interactúan, en este ensayo, fueron etiquetados con partes N- y C-terminales del YFP en los vectores pSPYNE-35S y pSPYCE-35S19, y su interacción da como resultado la reconstitución del YFP funcional que actúa como aceptor fret para el tercer socio que interactúa, que está etiquetado con CFP (actuando como donante FRET) (Figura 1 ). En este caso particular, el PPI entre dos monómeros M y entre M y C ha sido validado mediante la realización de BiFC en tres sistemas diferentes junto con el sistema de levadura-dos-híbrido. Estos vectores fueron movilizados en la cepa Agrobacterium tumifaciens GV3101 por electroporación. La cepa GV3101 tiene un plásmido Ti desarmado pMP90 (pTiC58DT-DNA) con resistencia a la gentamicina20. Se añadió una cepa p19 Agrobacterium junto con todas las infiltraciones para evitar el silenciamiento detransgenes 21. Recomendamos que las tres proteínas también se utilicen en conformaciones opuestas para validar las interacciones tripartitas.
En esta técnica, hemos empleado FLIM, donde en primer lugar, la vida útil de fluorescencia del donante (vida útil del donante no exprimida) se mide en ausencia de un aceptor. Después de eso, su vida útil se mide en presencia del aceptor (vida del donante apagado). Esta diferencia en las vidas de fluorescencia de los donantes se utiliza para calcular la eficiencia de FRET, que depende del número de fotones que exhiben una reducción en la vida útil de la fluorescencia. A continuación se menciona un protocolo detallado para determinar la formación de un complejo ternario entre tres proteínas cualesquiera expresando transitoriamente las proteínas marcadas con fluorescentes en Nicotiana benthamiana y ensayando su interacción por BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Las interacciones proteína-proteína son una parte integral de todos los procesos biológicos en las células, ya que desempeñan un papel crucial en la regulación, el mantenimiento y la modificación de las funciones celulares. Estas interacciones están involucradas en una amplia gama de fenómenos como la transducción de señales, la respuesta a patógenos, las interacciones célula-célula, los procesos metabólicos y de desarrollo. En el caso de los factores de transcripción, estas interacciones pueden conducir a la oligomerización de las subunidades, secuestrando en contextos subcelulares específicos como el núcleo, el citoplasma, etc., lo que, a su vez, podría tener un efecto más profundo en la expresión de los genes aguas abajo. Aquí, demostramos una metodología para visualizar la interacción tripartita in vivo utilizando la Transferencia de Energía de Resonancia de Förster (FRET) basada en la Complementación de Fluorescencia Bimolecular (BiFC) que involucra Imágenes de Por Vida de Fluorescencia (FLIM). Dos de las proteínas seleccionadas para esta demostración interactúan como socios biFC, y su actividad de fluorescencia reconstituida se utiliza para ensayar FRET-FLIM con el tercer socio. Se han utilizado plantas de Nicotiana benthamiana cultivadas en cámaras de crecimiento de cuatro a cinco semanas de edad como el sistema de planta modelo para esta demostración.

Este protocolo representa un método optimizado para estudiar in vivo las interacciones tripartitas proteína-proteína en plantas. El principio básico del protocolo es combinar dos técnicas de interacción de proteínas marcadas con fluorescencia, es decir, BiFC y FRET, para crear un ensayo para medir la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas. Aquí, hemos utilizado FLIM para medir la vida útil de fluorescencia del socio donante fret en presencia y ausencia del aceptor FRET. Se esp...

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Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Aquí presentamos, un método para visualizar la formación de complejos ternarios entre tres socios de proteínas utilizando proteínas marcadas con fluorescentes mediante el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC. Este método es valioso para estudiar los complejos de interacción proteína-proteína in vivo.

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

El estudio de las interacciones proteína-proteína proporciona una comprensión de la regulación de muchos procesos biológicos. Aquí demostramos un procedimiento descrito inicialmente por Y John shoe and co. Trabajadores en 2007, donde los autores han utilizado BiFC en combinación con FRET para validar la interacción tripartita entre tres moléculas de proteínas.Sin embargo, hemos incluido mediciones de la vida útil de la fluorescencia en este procedimiento para corroborar las mediciones de FRET. Para demostrar una interacción tripartita, hemos elegido una proteína, que se sabe homodimerizar. Además, también se ha validado internamente para interactuar con un sensor de calcio de proteína conocido como proteína C en este protocolo.Las proteínas MNC interactúan en el citoplasma. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteínas YFP divididas. Su interacción resulta en la restitución de YFP funcional que actúan como un aceptor de FRET para el tercer socio que interactúa, que se etiqueta con CFP que actúa como donante de FRET.Comenzar con la amplificación de las secuencias codificantes de los genes de interés que son genes M y C en nuestro caso mediante PCR y clonarlos en vectores de entrada apropiados. Validar clones que se seleccionan en los antibióticos que contienen placas por digestión de restricción y secuenciación de ADN. Movilizar los CDS reconstituidos de los clones de entrada a los vectores de destino.Todos los vectores utilizados en este experimento se enumeran en la tabla uno. Finalmente, transformar las células de agrobacterium GV3101 con los vectores de destino por electroporación. Aquí cultivamos plantas de Nicotiana Benthamiana todavía de cuatro a seis salen de etapa en condiciones controladas en una cámara de cultivo.Prepare la mezcla de suelo mezclando soilrita, turba de coco y compost en una proporción de 2: 1: 1. Extienda una capa de una pulgada de espesor de esta mezcla en una bandeja de plástico para hacer el lecho de tierra y saturarlo con un poco de agua. Espolvoree alrededor de 200 semillas sobre el suelo y transfiéralo a una bandeja más grande que aproximadamente un centímetro de agua estancada.Cubra esta bandeja con una envoltura de plástico para crear una cámara de humedad. Transfiera esta bandeja a una cámara de cultivo a 23 grados centígrados con 16 horas de luz y ocho horas de ciclo oscuro. Después de dos semanas, transfiera las plántulas jóvenes a macetas pequeñas de tres a cuatro pulgadas que contengan una mezcla de suelo saturado de agua.Coloque estas macetas en bandejas de plástico y transfiéralas a la cámara de cultivo durante cuatro semanas más. Para la agroinfiltración, las cepas bacterianas deben ser recién subcultivadas y mezcladas junto con la cepa P19 de agrobacterium en proporciones apropiadas. Comience este procedimiento inoculando cepas de agrobacterias GV3101 que contengan construcciones BiFC y FRET a partir de placas de rayas en 10 ml.al caldo que contiene antibióticos apropiados. Además, también se inicia un cultivo de la cepa P19 de agrobacterias, que se añade para evitar el silenciamiento de los transgenes. Cubra el matraz con papel de aluminio y manténgalos en un agitador de incubadora, colóquelo a 28 grados centígrados a 170 RPM durante 16 horas.Después del crecimiento durante la noche, transfiera 1 ml. de estos cultivos a un codo desechable para medir la densidad óptica a 600 nanómetros mediante el uso de un espectrofotómetro. Mezclar los cultivos de las cepas apropiadas de BiFC y FRET partner que contengan cepas de modo que el OD final sea de 0,5 Y el de P19 sea de 0,3 en un volumen total de 2 ml.Para lograr estas proporciones seguimos la fórmula que se muestra en la pantalla para estos cálculos. Centrifugar los cultivos mixtos de agrobacterias a 3000G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Suspende los pellets en un 2 ml.búfer de infiltración. Es posible que tenga que usar un mezclador de vórtice para volver a suspender las células en una suspensión celular homogénea por completo. Después de esto, incube los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres horas.Mientras tanto, etiquete cada maceta para la mezcla de construcción con la que se va a infiltrar. Llene una jeringa sin aguja de 1 ml. con la mezcla agrobacteriana.Presione suave pero firmemente la punta de la jeringa hacia el lado abaxial de una hoja completamente expandida mientras apoya la hoja desde el otro lado. Empuje suavemente el émbolo hasta que la solución se llene en el área de la hoja equivalente de dos a tres veces como la de la punta de la jeringa. Infiltrar la mezcla bacteriana en hasta cuatro puntos en una hoja y repetir este procedimiento durante tres a cuatro hojas para un tipo de infiltración.Además, incluya al menos dos plantas por construcción para la infiltración. Recuerde limpiarse las manos con alcohol al 70% o cambiarse los guantes para evitar cualquier contaminación cruzada. Transfiera todas las macetas a una bandeja e incube en la cámara de crecimiento en la misma condición de crecimiento.Revise una pequeña parte de la hoja agroinfiltrada con un microscopio de fluorescencia. Cuando la fluorescencia tanto de YFP como de CFP son detectables en las células, proceda al microscopio confocal para el ensayo BiFC FRET-FLIM. En nuestro caso, este análisis se realizó tres días después de la agroinfiltración.Ahora que las plantas están listas para ser visualizadas bajo un microscopio, corte muestras de hojas cuadradas de cinco a 8 mm. de distancia de la punta de la jeringa enrollada y móntelas en agua destilada. Coloque un resbalón de cubierta limpia sobre él y selle.Visualice estas muestras en un microscopio de barrido láser confocal. En este procedimiento, la base para determinar y cuantificar la interacción entre dos proteínas es la reducción de la vida útil de fluorescencia del socio donante fret sobre su interacción con el aceptor, que se utiliza para calcular la eficiencia de FRET. La complejidad en el caso de la interacción tripartita aumenta aún más porque el aceptor FRET en este caso no es una sola molécula, sino un par YFP BiFC dividido, que primero debe reconstituirse in vivo para convertirse en un fluoróforo aceptor FRET funcional.Para llevar a cabo FRET-FLIM, tenemos que determinar la vida útil de fluorescencia de las moléculas donantes, primero solas y luego en presencia de un socio FRET. Abra la aplicación FLIM en el microscopio de barrido láser confocal, inicie la consola y utilice el recuento de fotones de reconocimiento de patrones para medir la vida útil de la fluorescencia. Seleccione el modo de medición estándar de conteo de todos los fotones.Tomaremos dos tipos de plantas agroinfiltradas. Uno que tiene el gen CCFP y el otro que tiene CCFP junto con MYFP porque la interacción de la proteína M ya ha sido validada con la proteína C utilizando BiFC e Y2H, esperamos una buena eficiencia FRET con este par que interactúa. Ahora primero escaneamos la hoja agroinfiltrada CCFP y buscamos una célula que muestre buena fluorescencia CFP.La configuración del microscopio se muestra en la pantalla. La muestra se ilumina a una potencia láser suficiente para alcanzar aproximadamente 0,1 fotones por pulso. Para muestras con intensidad de fluorescencia variable, capturaremos 50 fotogramas para recolectar fotones adecuados necesarios para la medición de la vida útil.Como se sabe que la PPC exhibe dos vidas de fluorescencia debido a su adaptación confirmacional, alimentamos los datos utilizando un modelo de reconvolución exponencial mientras mantenemos el valor de N igual a dos. En estos ajustes, las dos vidas útiles son visibles a uno y 3,2 nanosegundos. Usaremos la vida útil más alta para todos los cálculos posteriores.Ahora estamos listos para medir FRET entre CCFP y MYFP. Para esto usemos la muestra de hoja de la planta agroinfiltrada con CCFP y MYFP. Buscamos una célula que exprese tanto CCFP como MYFP y confirmemos sus respectivos patrones de emisión excitándolos utilizando láser de pulso completo de 40 nanómetros y láser de luz blanca de 514 nanómetros.Después de eso, cambiamos a la consola FLIM para medir la vida útil de CFP utilizando la misma configuración que usamos anteriormente para medir la vida útil de CCFP. Pero esta vez la célula también está expresando MYFP que potencialmente puede interactuar con CCFP y causar una reducción en la vida útil de CCFP. Como hemos leído el gráfico obtenido utilizando el modelo de reconvolución exponencial N con N igual a dos, de hecho hay una disminución en la vida útil de CFP de 3,2 a 2,6 nanosegundos.Ahora iniciamos la consola FRET en el software y calculamos la eficiencia FRET ingresando manualmente la vida útil incuestionable en la ecuación proporcionada en el software y la eficiencia FRET observada es del 56% Ahora pasemos al paso final, es decir, visualizar la interacción entre tres socios. Para ello, tomamos la muestra de hoja de una planta que fue coinfiltrada con CCFP y MYFPN con MYFPC. Escaneamos la planta de la hoja en busca de una célula que muestre cfp y fluorescencia YFP reconstituida que emana de la interacción entre dos proteínas M.Utilizamos el mismo láser y la misma longitud de onda de emisión que se usaba anteriormente. Posteriormente, apagamos el láser de 514 nanómetros y pasamos a la consola FLIM. Si el dímero MYFP interactúa con CCFP.Deberíamos ver una reducción en la vida útil de CCFP como se observa durante su interacción con MYFP. Sin embargo, si el CCFP no interactúa con el dímero MYFP, su vida útil de fluorescencia debe permanecer observada a 3,2 nanosegundos. Utilizando la configuración similar a la mencionada anteriormente, medimos la vida útil de la PPC en presencia de YFP reconstituida.Ajustamos el gráfico usando el modelo de reconvolución exponencial N con un igual a dos y pasamos a la consola FRET. Y sí, hay una disminución en la vida útil de la PPC de 3,2 a 2,3 nanosegundos. Calculamos la eficiencia FRET como se describió anteriormente.La eficiencia FRET calculada es del 55% Aquí hemos utilizado FLIM para medir la vida útil de fluorescencia del socio donante FRET en presencia y ausencia del aceptor FRET. Se esperaba una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante si había una interacción positiva entre las dos proteínas. En caso de control positivo, eso es CCFP y MYFP.Observamos una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante de 3,3 a 2,5 nanosegundos y la eficiencia FRET fue del 56%Un ejercicio similar con YFP reconstituido resultó de la interacción entre dos amonómeros y proteínas C también resultó en una interacción FRET positiva que condujo a la reducción de la vida útil de fluorescencia del donante a 2,6 nanosegundos. La eficiencia FRET calculada fue de aproximadamente el 55% en este caso. La reducción en la vida útil de fluorescencia del donante FRET proporciona una fuerte evidencia de una interacción tripartita entre estas proteínas.El protocolo descrito aquí es una herramienta poderosa para determinar las interacciones tripartitas proteína-proteína en las células vivas. Este procedimiento también puede ayudar a determinar la localización intracelular de los complejos resultantes, lo cual es importante para descifrar la función y el significado fisiológico de cualquier complejo de proteínas. En conclusión, el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC brinda la oportunidad de estudiar y caracterizar aspectos importantes de las interacciones tripartitas de proteínas, lo que puede ser útil en estudios de interacción proteína-proteína en sistemas animales y vegetales.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

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Investigación

Biología

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