Name: determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

OBS, GG, SB, KC tackar uppriktigt University Grants Commission (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE och Council for Scientific and Industrial Research (CSIR) för deras forskarstipendier. Vi erkänner tack och lov departementet för bioteknik (DBT), Indiens regering, Department of Science and Technology (DST-FIST), Indiens regering för ekonomiskt stöd.

1. Kloning av gener i inmatnings- och destinationsvektorer (figur2)
<ol><li>Förstärka kodningssekvensen (CDS) av de gener av intresse (M- och C-gener i vårt fall) med PCR och klona dem i lämpliga inmatningsvektorer (t.ex. pENTR/D-TOPO vektor; Se tabell 1 för vektorer som används i det här experimentet).</li>
	<li>Odla klonerna på tallrikar som innehåller antibiotika. Validera kloner som väljs på antibiotika genom att be...

<ol>
	<li>Grove, C. A., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+functionality+and+transcription+regulatory+networks.">Transcription factor functionality and transcription regulatory networks.</a> Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).</li><li>Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+your+partners:+dimerization+in+eukaryotic+transcription+factors.">Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).</li><li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MADS-box+gene+family+in+rice:+genome-wide+identification,+organization+and+expression+profiling+during+reproductive+development+and+stress.">MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress.</a> BMC Genomics. 8 (242), (2007).</li><li>Thei&#223;en, G., Gramzow, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+plant+MADS+domain+transcription+factors.">Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors.</a> Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).</li><li>Schweiger, R., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+visualized+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+tobacco+protoplasts+and+leaves.">Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).</li><li>Bracha-Drori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+plants+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).</li><li>Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+bimolecular+fluorescence+complementation+and+f&#246;rster+resonance+energy+transfer+reveals+ternary+SNARE+complex+formation+in+living+plant+cells.">Combined bimolecular fluorescence complementation and f&#246;rster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells.</a> Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).</li><li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+protein-protein+interactions+using+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+(FLIM).">Screening for protein-protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+fundamentals+and+advances+in+instrumentation,+analysis,+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+FRET-FLIM+labeling+conditions+to+detect+nuclear+protein+interactions+at+native+expression+levels+in+living+Arabidopsis+roots.">Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).</li><li>Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+highly+efficient+method+for+transient+gene+expression+in+rice+plants.">A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants.</a> Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).</li><li>Kudla, J., Bock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+the+way+to+protein-protein+interactions:+Recommendations+on+best+practices+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analyses.">Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses.</a> Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).</li><li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+complementation:+an+emerging+tool+for+biological+research.">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+bimolecular+fluorescence+complementation+assay+with+a+high+signal-to-noise+ratio.">An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio.</a> BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+A+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives.</a> BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSITE+vectors+for+stable+integration+or+transient+expression+of+autofluorescent+protein+fusions+in+plants:+Probing+Nicotiana+benthamiana-+Virus+Interactions.">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).</li><li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).</li><li>Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Agrobacterium+binary+Ti+vectors.">A guide to Agrobacterium binary Ti vectors.</a> Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).</li><li>Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+migration+in+gel+filtration+of+the+Cf-4+and+Cf-9+resistance+proteins+is+an+intrinsic+property+of+Cf+proteins+and+not+because+of+their+association+with+high-molecular-weight+proteins.">Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins.</a> Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).</li><li>Xie, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+SARS-CoV-2+using+a+reverse+genetic+system.">Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system.</a> Nature Protocols. 16, (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+plasmid+construction+strategy+for+Cas9.">Optimized plasmid construction strategy for Cas9.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).</li><li>Mattanovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Agrobacterium+spp.+by+electroporation.">Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Tramier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picosecond-hetero-FRET+microscopy+to+probe+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).</li><li>Alvarez, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP8+FALCON:+a+novel+concept+in+fluorescence+lifetime+imaging+enabling+video-rate+confocal+FLIM.">SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM.</a> Nature Methods. 20, 2-4 (2019).</li><li>Postma, M., Goedhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plotsofdata-a+web+app+for+visualizing+data+together+with+their+summaries.">Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries.</a> PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).</li><li>Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-chromophore+fret+microscopy+to+analyze+multiprotein+interactions+in+living+cells.">Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).</li><li>Waadt, R., Kudla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+visualization+of+protein+interactions+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC).">In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).</li></ol>

Detta protokoll visar användningen av BiFC-baserade FRET-FLIM analys för att fastställa bildandet av ett ternary komplex mellan två monomerer av en MADS-box protein och en kalciumsensor protein. Protokollet är anpassat från en rapport av Y. John Shyu et al. där de har utvecklat en BiFC-baserad FRET-metod för att visualisera ternarykomplex som bildas mellan Fos-Jun heterodimers och NFAT eller p65 med hjälp av den sensibiliserade utsläppsmetoden7. Tidigare utvecklades ett trefluofor FRET-s...

Protein-proteininteraktioner (PPIs) utgör grunden för att eukaryota celler fungerar korrekt genom att reglera olika metaboliska och utvecklingsmässiga processer. Vissa protonpumpshämmare är stabila, medan andra är övergående till sin natur. Interaktionerna kan kategoriseras baserat på antalet och typen av medlemmar i interaktionen, till exempel dimeriska, trimeriska, tetrameriska homomeriska och heteromeriska1. Identifiering och karakterisering av proteininteraktioner kan leda till en bättre förståelse av proteinfunktioner och regulatoriska nätverk.
Transkriptionsfaktorer är proteiner som är involverade i regulatoriska funktioner. De reglerar transkriptionen av deras nedströmsgener genom att binda till DNA. Ibland oligomerisering eller bildning av högre ordningskomplex av proteiner är en förutsättning för att utföra sina funktioner2. Växt MADS-box transkriptionsfaktorer är homeotiska gener som reglerar olika processer som blomövergång, blommig organutveckling, befruktning, fröutveckling, senescens och vegetativ utveckling. De är kända för att bilda högre ordningens komplex som binder till DNA3,4. Att studera PPI-nätverk bland transkriptionsfaktorer och deras interactorer ger insikter om komplexiteten bakom transkriptionsreglering.
Övergående proteinuttryck i Nicotiana benthamiana har varit ett populärt tillvägagångssätt för att studera proteinlokalisering eller protein-proteininteraktioner in vivo5. BiFC och FRET är metoder för att studera protein-protein interaktioner in vivo med fluorescerande reportersystem6. En kombination av dessa två tekniker har visat sig avslöja interaktionen mellan tre proteiner7. FRET mäts med hjälp av acceptor photobleaching, sensibiliserad emission och Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) teknik. FLIM-baserad FRET-analys har dykt upp som ett verktyg som ger exakt kvantifiering och spatiotemporal specificitet till energiöverföringsmätningar mellan två molekyler baserat på deras fluorescenslivslängd8. FLIM mäter den tid då en fluorofor stannar i ett upphetsad tillstånd innan den avger en foton och är bättre än tekniker som använder intensitetsmätningar ensam9,10. Förutom heterologa system som Nicotiana benthamiana och lök epidermal peeling, nyare rapporter har visat användningen av Arabidopsis rötter och unga risplantor, etc., för in vivo analys av protein-protein interaktioner under inhemska förhållanden11,12.
Förutom ett lämpligt uttryckssystem är valet av samverkande partner för BiFC- och FRET-analyser också avgörande för att detta experiment ska lyckas. PPI bland partner som används i BiFC-konfigurationen bör valideras med lämpliga kontroller innan de används som konjugerad partner i FRET-experimentet13. BiFC använder den strukturella komplementeringen av N- och C-terminaldelar av det fluorescerande proteinet. En vanlig begränsning i de flesta om inte alla fluorescerande proteiner som används i BiFC-analyser har varit självmonteringen mellan de två derivata ickefluorescensfragmenten, vilket bidrar till falskt positiv fluorescens och minskar förhållandet mellan signal och brus (S/N)14. Den senaste utvecklingen, inklusive punktmutationer eller position för att dela upp det fluorescerande proteinet, har gett upphov till BiFC-par med ökad intensitet, högre specificitet, högt S/N-förhållande15,16. Dessa fluorescerande proteiner kan också användas för att utföra BiFC beroende på experimentets lämplighet.
Traditionellt har den gemensamma fiskeripolitiken och YFP använts som donatorpar och acceptorpar i FRET-experiment17. YFP eller m-Citrine befanns dock vara bättre FRET-givare (när de används med RFP som acceptor) på grund av det höga kvantutbytet (QY) under det inhemska uttrycket av målproteiner i Arabidopsis rotsystem. Valet av promotorer (konstituerande kontra infödda/endogena) och fluorofor spelar också en avgörande roll vid utformningen av ett framgångsrikt BiFC-FRET-FLIM-experiment. Det är viktigt att notera att fret-donatorernas effektivitet och fret-parens lämplighet tenderar att förändras i och med förändringen i promotorn och det biologiska system som används för uttryck. Fluoroforens QY, som relaterar till dess ljusstyrka, beror på pH, temperatur och det biologiska system som används. Vi föreslår att dessa kriterier noggrant övervägs innan du väljer fluorophore paret för FRET experiment. Det biologiska systemet, promotorerna och de proteiner som används för detta protokoll fungerade bra med CFP-YFP fluorophores för BiFC FRET-FLIM-experimentet.
I den aktuella studien införlivar vi funktionen hos FLIM för att visualisera interaktionen mellan tre proteinmolekyler med BiFC-baserad FRET. I denna teknik är två proteiner taggade med delat YFP-protein och det tredje proteinet med CFP. Eftersom vi var intresserade av att studera interaktionen mellan en MADS-box protein (M) homodimer med ett kalciumsensorprotein (C), var dessa proteiner taggade med fluorescerande proteiner i pSITE-1CA och pSITE-3CA vektorer18. Två av de samverkande partnerna, i denna analys, taggades med N- och C-terminaldelar av YFP i pSPYNE-35S och pSPYCE-35S vektorer19,och deras interaktion resulterar i rekonstitution av den funktionella YFP som fungerar som fret-acceptor till den tredje samverkande partnern, som är märkt med CFP (fungerar som FRET-givare) (figur 1 ). I detta särskilda fall har PPI mellan två M-monomerer och mellan M och C validerats genom att bifc utförs i tre olika system tillsammans med jäst-två-hybridsystemet. Dessa vektorer mobiliserades till Agrobacterium tumifaciens GV3101 stam genom elektroporation. GV3101-stammen har en avväpnad Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens20. En p19 Agrobacterium stam tillsattes tillsammans med alla infiltrationer för att förhindra transgene ljuddämpning21. Vi rekommenderar att de tre proteinerna också används i motsatta konformationer för att validera trepartsinteraktionerna.
I denna teknik har vi använt FLIM, där först givarens fluorescenslivslängd (unquenched donor lifetime) mäts i avsaknad av en acceptor. Därefter mäts dess livslängd i närvaro av acceptorn (släckt donatorlivslängd). Denna skillnad i donatorfluorescenslivslängder används för att beräkna FRET-effektiviteten, vilket beror på antalet fotoner som uppvisar en minskning av fluorescenslivslängden. Nedan nämns ett detaljerat protokoll för att bestämma bildandet av ett ternary komplex mellan tre proteiner genom att tillfälligt uttrycka fluorescerande-taggade proteiner i Nicotiana benthamiana och analysera deras interaktion av BiFC-FRET-FLIM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringes without needles</td>
			<td>Dispovan</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway&#160; LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>11791020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>K240020</td>
			<td>The vectors used in the study are Gateway based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F530-S</td>
			<td>Any High fidelity Polymerase can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS1889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 FALCON</td>
			<td>Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of tripartite interaction between two monomers of a mads-box transcription factor and a calcium sensor protein by bifc-fret-flim assay

Protein-protein interaktioner är en integrerad del av alla biologiska processer i cellerna eftersom de spelar en avgörande roll för att reglera, underhålla och ändra cellulära funktioner. Dessa interaktioner är involverade i ett brett spektrum av fenomen som signaltransduktion, patogenrespons, cell-cellinteraktioner, metaboliska och utvecklingsmässiga processer. När det gäller transkriptionsfaktorer kan dessa interaktioner leda till oligomerisering av underenheter, bindning i specifika subcellulära sammanhang som kärnan, cytoplasma etc., vilket i sin tur kan ha en mer djupgående effekt på uttrycket av de nedströms generna. Här demonstrerar vi en metodik för att visualisera in vivo trepartsinteraktion med bimolekulär fluorescenskompletering (BiFC) baserad Förster Resonance Energy Transfer (FRET) som involverar Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Två av de proteiner som valts ut för denna demonstration samverkar som BiFC-partners, och deras rekonstituerade fluorescensaktivitet används för att analysera FRET-FLIM med den tredje partnern. Fyra till fem veckor gamla tillväxtkammare odlade Nicotiana benthamiana växter har använts som modell växtsystem för denna demonstration.

Detta protokoll representerar en optimerad metod för att studera in vivo trepartsprotein-protein interaktioner i växter. Grundprincipen i protokollet är att kombinera två fluorescensmärkta proteininteraktionstekniker, det vill säga BiFC och FRET, för att skapa en analys för att mäta ternarykomplex bildning mellan tre proteinpartners. Här har vi använt FLIM för att mäta FRET-givarpartnerns fluorescenslivslängd i närvaro och frånvaro av FRET-acceptorn. En minskning av fluorescensens livslängd för...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay at JoVE.c

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Här presenterar vi, en metod för att visualisera ternary komplex bildning mellan tre proteinpartners med fluorescerande-märkta proteiner av BiFC-baserade FRET-FLIM analys. Denna metod är värdefull för att studera protein-protein interaktionskomplex in vivo.

Bestämning av trepartsinteraktion mellan två monomerer av en MADS-box transkriptionsfaktor och ett kalciumsensorprotein av BiFC-FRET-FLIM-analys

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Studien av protein-proteininteraktioner ger en förståelse för regleringen av många biologiska processer. Här visar vi en procedur som beskrivs initial av Y John sko och co. Arbetare 2007, där författarna har använt BiFC i kombination med FRET för att validera trepartsinteraktionen mellan tre proteinmolekyler.Vi har dock inkluderat fluorescens livstidsmätningar i detta förfarande för att underbygga FRET mätningar. För att demonstrera en trepartsinteraktion har vi valt ett protein, som är känt för att homodimerisera. Dessutom har det också validerats internt för att interagera med en kalciumsensor av protein som kallas C-protein i detta protokoll.MNC-proteinerna interagerar i cytoplasma. I denna teknik är två proteiner taggade med delade YFP-proteiner. Deras interaktion resulterar i att funktionella YFP som fungerar som fret-acceptor till den tredje samverkande partnern, som är märkt med CFP som fungerar som en FRET-givare.Börja med förstärkningen av kodningssekvenserna av de gener av intresse som är M- och C-gener i vårt fall av PCR och klona dem i lämpliga ingångsvektorer. Validera kloner som väljs på antibiotika som innehåller plattor genom begränsningssammandrag och DNA-sekvensering. Mobilisera de rekonstituerade CDS'från ingångskloner till målvektorerna.Alla vektorer som används i det här experimentet visas i tabell ett. Slutligen omvandla agrobakterier GV3101 celler med destination vektorer genom elektroporation. Här växer vi Nicotiana Benthamiana växter fortfarande fyra till sex lämnar scenen i kontrollerade förhållanden i en växande kammare.Förbered jordblandningen genom att blanda jordört, kokostorv och kompost i ett förhållande av 2:1:1. Sprid ett 1 tum tjockt lager av denna blandning i en plastbricka för att göra jordbädden och mätta den med lite vatten. Strö ca 200 frön ovanpå jorden och överför den till en större bricka som ungefär en centimeter stående vatten.Täck denna bricka med plastfolie för att skapa en fuktkammare. Överför denna bricka till en odlingskammare som är inställd på 23 grader celsius med 16-timmars ljus och åtta timmars mörk cykel. Efter två veckor överför de unga plantorna till små tre till fyra tums krukor som innehåller vattenmättad jordblandning.Placera dessa krukor i en plastbricka och överför dem till odlingskammaren i fyra veckor till. För agroinfiltrering måste bakteriestammarna vara nyodlade och blandade tillsammans med P19-stammen av agrobacterium i lämpliga förhållanden. Starta denna procedur genom att inokurera GV3101 agrobacteriumstammar som innehåller BiFC- och FRET-konstruktioner från streckplattor i 10 ml.buljong som innehåller lämplig antibiotika. Vid sidan av initiera också en kultur av P19 stam av agrobakterier, som tillsätts för att förhindra transgene ljuddämpning. Täck kolven med aluminiumfolie och håll dem i en inkubatorskak, ställ in den 28 grader celsius vid 170 RPM i 16 timmar.Efter den över natten tillväxtöverföringen 1 ml. av dessa kulturer till en engångs cubit för att mäta den optiska densiteten på 600 nanometer med hjälp av en spektrofotometer. Blanda kulturerna hos lämplig BiFC- och FRET-partner som innehåller stammar så att den slutliga OD är 0,5 Och P19 är 0,3 i en total volym på 2 ml.För att uppnå dessa nyckeltal följer vi formeln som visas på skärmen för dessa beräkningar. Centrifugera de blandade agrobakteriernas kulturer vid 3000 G i fem minuter vid rumstemperatur och kassera försiktigt supernatanten. Suspendera pelletsen i en 2 ml.infiltrationsbuffert. Du kan behöva använda en virvelblandare för att suspendera cellerna i en homogen cellfjädring helt. Efter detta inkuberar rören vid rumstemperatur i mörkret i tre timmar.Under tiden, märk varje växtkruka för konstruktionsblandningen som den kommer att infiltreras med. Fyll en 1 ml nållös spruta med den agrobakteriella blandningen.Tryck försiktigt men bestämt sprutans spets till abaxialsidan av ett helt expanderat blad samtidigt som bladet stöds från andra sidan. Tryck försiktigt på kolven tills lösningen fylls i bladområdet motsvarande två till tre gånger som sprutspetsens. Infiltrera bakterieblandningen på upp till fyra ställen på ett blad och upprepa denna procedur för tre till fyra löv för en typ av infiltration.Inkludera också minst två växter per konstruktion för infiltration. Kom ihåg att torka händerna med 70% alkohol eller byt handskar för att förhindra korskontaminering. Överför alla krukor till en bricka och inkubera i tillväxtkammaren vid samma tillväxttillstånd.Kontrollera en liten del av det agroinfiltrerade bladet med hjälp av ett fluorescensmikroskop. När fluorescensen från både YFP och CFP kan detekteras i celler fortsätt till det konfokala mikroskopet för BiFC FRET-FLIM-analys. I vårt fall utfördes denna analys tre dagar efter agroinfiltration.Nu när plantorna är redo att visualiseras under ett mikroskop skär fyrkantiga bladprover från fem till 8 mm. från sprutspetssåret och montera dem på destillerat vatten. Placera ett rent lock över det och försegla.Visualisera dessa prover i konfokal laserskanningsmikroskop. I detta förfarande är grunden för att bestämma och kvantifiera interaktionen mellan två proteiner minskningen av FRET-donatorpartnerns fluorescenslivslängd vid dess interaktion med acceptorn, som används för att beräkna fretens effektivitet. Komplexiteten i fallet med trepartsinteraktion ökar ytterligare eftersom FRET acceptor i detta fall inte är en enda molekyl, men ett delat YFP BiFC-par, som först bör rekonstitueras in vivo för att bli en funktionell FRET acceptor fluorophore.För att utföra FRET-FLIM måste vi bestämma donatormolekylernas fluorescenslivslängd, först ensam och sedan i närvaro av en FRET-partner. Öppna FLIM-applikationen i det konfokala laserskanningsmikroskopet, starta konsolen och använd fotoräkning av mönsterigenkänning för att mäta fluorescenslivslängden. Välj standardmåttläge för alla fotonräkningar.Vi kommer att ta två typer av agroinfiltrerade växter. En som har CCFP-genen och den andra som har CCFP tillsammans med MYFP eftersom interaktionen mellan M-protein redan har validerats med C-proteinet med BiFC och Y2H, förväntar vi oss god FRET-effektivitet med detta interagerande par. Nu skannar vi först CCFP agroinfiltrated blad och letar efter en cell som visar bra CFP fluorescens.Mikroskopinställningarna visas på skärmen. Provet belyses med tillräcklig lasereffekt för att uppnå cirka 0,1 fotoner per puls. För prover med varierande fluorescensintensitet kommer vi att fånga 50 ramar för att samla in lämpliga fotoner som krävs för livstidsmätningen.Eftersom den gemensamma fiskeripolitiken är känd för att uppvisa två fluorescenslivslängder på grund av dess bekräftelseanpassning, matar vi data med hjälp av en exponentiell rekognoeringsmodell samtidigt som värdet på N är lika med två. Vid dessa inställningar är de två livstiderna synliga på en och 3,2 nanosekunder. Vi kommer att använda den högre livslängden för alla efterföljande beräkningar.Vi är nu inställda på att mäta FRET mellan CCFP och MYFP. För detta låt oss använda bladprovet från den agroinfiltrerade växten med CCFP och MYFP. Vi letar efter en cell som uttrycker både CCFP och MYFP och bekräftar deras respektive utsläppsmönster genom att spännande dem med full 40 nanometer pulslaser och 514 nanometer vit ljuslaser.Därefter byter vi till FLIM-konsolen för att mäta livslängden för CFP med samma inställningar som vi använde tidigare för att mäta livslängden för CCFP. Men den här gången uttrycker cellen också MYFP som potentiellt kan interagera med CCFP och orsaka en minskning av CCFP: s livstid. När vi har läst grafen som erhållits med hjälp av N exponentiell rekonvolutionsmodell med N lika med två, finns det faktiskt en minskning av den gemensamma fiskeripolitikens livslängd från 3,2 till 2,6 nanosekunder.Vi startar nu FRET-konsolen i programvaran och beräknar FRET-effektiviteten genom att manuellt ange obestridlig livslängd i ekvationen som tillhandahålls i programvaran och den observerade FRET-effektiviteten är 56%Nu låt oss nu gå vidare till det sista steget, det vill säga att visualisera interaktionen mellan tre partners. För detta tar vi bladprovet från en växt som var saminfiltrerad med CCFP och MYFPN med MYFPC. Vi skannar bladplantan efter en cell som visar både CFP och rekonstituerad YFP fluorescens som härrör från interaktion mellan två M-proteiner.Vi använder samma laser- och emissionsvåglängd som tidigare. Därefter stänger vi av 514 nanometerslasern och flyttar till FLIM-konsolen. Om MYFP-toren interagerar med CCFP.Vi bör se en minskning av CCFP:s livslängd, vilket observerats under dess interaktion med MYFP. Men om CCFP inte interagerar med MYFP-dimern bör dess fluorescenslivslängd förbli sedd vid 3,2 nanosekunder. Med hjälp av liknande inställningar som nämnts ovan mäter vi den gemensamma fiskeripolitikens livslängd i närvaro av rekonstituerad YFP.Vi monterar diagrammet med hjälp av N exponential reconvolution-modellen med en lika med två och flyttar till FRET-konsolen. Och ja, det finns en minskning av den gemensamma fiskeripolitikens livslängd från 3,2 till 2,3 nanosekunder. Vi beräknar FRET-effektiviteten enligt beskrivningen ovan.Den beräknade FRET-effektiviteten är 55%Här har vi använt FLIM för att mäta FRET-givarpartnerns fluorescenslivslängd i närvaro och frånvaro av FRET-acceptorn. En minskning av fluorescensens livslängd för givaren förväntades om det fanns en positiv interaktion mellan de två proteinerna. Vid positiv kontroll är det CCFP och MYFP.Vi observerar en minskning av fluorescens livslängden för givaren från 3,3 till 2,5 nanosekunder och FRET-effektiviteten var 56%En liknande övning med rekonstituerad YFP resulterade från interaktionen mellan två amonomerer och C-proteiner resulterade också i en positiv FRET-interaktion som ledde till minskningen av fluorescenslivslängden för givaren till 2,6 nanosekunder. Den beräknade FRET-effektiviteten var cirka 55%i detta fall. Minskningen av FRET-givarens fluorescenslivslängd ger ett starkt bevis för en trepartsinteraktion mellan dessa proteiner.Protokollet som beskrivs här är ett kraftfullt verktyg för att bestämma treparts protein-protein interaktioner i levande celler. Denna procedur kan också hjälpa till att bestämma den intracellulära lokaliseringen av de resulterande komplexen, vilket är viktigt för att dechiffrera funktionen och fysiologiska betydelsen av något proteinkomplex. Sammanfattningsvis ger BiFC-baserade FRET-FLIM-analyser en möjlighet att studera och karakterisera viktiga aspekter av trepartsproteininteraktioner, vilket kan vara till hjälp i protein-proteininteraktionsstudier i både djur- och växtsystem.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera om musen Embryonala fibroblasts med en fyra transkriptionsfaktor, Doxycyklin inducerbara Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescens komplement (BiFC) analys av protein-protein interaktion i lök celler med Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Övervakning dynamiska förändringar i mitokondriernas kalciumnivåer under apoptos Använda en genetiskt kodade Kalcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay-analys: Ett protokoll till Test Interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En vätskefas affinitetsinfångning Analys med användning av magnetiska pärlor för att studera protein-proteininteraktion: polioviruset-Nanobody Exempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

En känslig och specifik Kvantifiering Metod för fastställande av Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C av elektrokemiluminiscens Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Karaktärisering av G-proteinkopplade receptorer av en fluorescensbaserad kalciummobilisering Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Fastställande av protein-ligand interaktioner Använda Differential Scanning fluorimetri

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...